UPLC-MS/MS法測定嬰配乳粉中9種孕激素殘留

葛城，張浩，劉鋼，詹勝群，周榮杰*

澳優(yōu)乳業(yè)（中國）有限公司（長沙 410200）

嬰配乳粉作為嬰幼兒主要食物來源之一[1]，其安全性備受關(guān)注，其中孕激素類就是受到關(guān)注的熱點(diǎn)之一。嬰配乳粉中孕激素可分為外源性和內(nèi)源性[2-4]，外源性孕激素可能是環(huán)境因素引入，也可能是為了提高奶牛產(chǎn)量或進(jìn)行治療而人為注射引入[5]，內(nèi)源性為奶牛自身在產(chǎn)奶過程中所分泌。孕激素的攝入將對嬰幼兒生長發(fā)育造成嚴(yán)重影響，因此對其檢測、監(jiān)控尤為重要。

食品中各種激素殘留檢測方法有高效液相色譜法[6-11]、氣相色譜法[13-14]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[15-23]、氣相色譜質(zhì)譜法[24-25]、酶聯(lián)免疫法[26,29]等。其中高效液相色譜法和氣相法靈敏度低，對牛奶樣品同時檢測多種激素的要求尤顯不足；氣相色譜質(zhì)譜法需要通過衍生得到易于揮發(fā)的穩(wěn)定衍生物才可測定，操作復(fù)雜；酶聯(lián)免疫法是利用抗原和抗體的免疫反應(yīng)進(jìn)行測定的分析方法，方法選擇性強(qiáng)、檢出限低，但存在假陽性等問題，一般用于篩查；超高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性強(qiáng)、靈敏度高，通過碎片離子信息可降低發(fā)生假陽性概率，因此可用該方法檢測食品中多種激素殘留。

試驗(yàn)通過建立同時檢測嬰配乳粉中多種孕激素殘留的UPLC-MS/MS法，采用乙腈沉淀、HLB固相萃取柱凈化，能對乳粉基質(zhì)中的9種孕激素進(jìn)行有效分析和測定，為嬰幼兒配方乳粉風(fēng)險監(jiān)控方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

50 mL離心管（美國Corning公司）；Oasis? HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，美國Waters公司）；電動連續(xù)分液器（E3x，量程1 μL～50 mL，德國Eppendorf公司）；嬰幼兒配方乳粉（市售）。

甲醇、甲酸（液質(zhì)級，德國CNW公司）；乙腈、正己烷（色譜級，德國CNW公司）。

炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品、21α-羥基孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、17α-羥基孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、甲基炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)品、甲羥孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸甲地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、甲羥孕酮乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于97%，德國Dr.E Hrenstorfer Gmbh公司）；乙酸氯地孕酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.3%，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）；炔諾孕酮-d6、甲羥孕酮-d3、甲地孕酮乙酸酯-d3同位素內(nèi)標(biāo)（加拿大Toronto Research Chemicals）；美倫孕酮-d5同位素內(nèi)標(biāo)（北京BePure標(biāo)準(zhǔn)品公司）；炔諾酮-13C2同位素內(nèi)標(biāo)（英國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室）；孕酮-d9同位素內(nèi)標(biāo)（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Endura高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配備ESI源，美國Thermo Fisher公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；離心機(jī)（3K15，德國Sigma公司）；電子天平（ME204E，METTLER TOLEDO）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

各孕激素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

各孕激素同位素內(nèi)標(biāo)儲備液（0.1 mg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取1.0 mg同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

同位素內(nèi)標(biāo)混合液：移取0.2 mL炔諾酮-13C2儲備液、0.1 mL其余5種同位素內(nèi)標(biāo)儲備液于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋、定容至刻度，在-18 ℃以下保存。

孕激素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：移取0.5 mL炔諾酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液、0.2 mL其余8種孕激素標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用1∶1甲醇水稀釋、定容，得到標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ；將標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅰ用1∶1甲醇水稀釋10倍得到標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ；將標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ用1∶1甲醇水稀釋20倍得到標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅲ。分別移取0.1，0.2，0.5和1 mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅲ及0.1和0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液Ⅱ于6個10 mL容量瓶中，移取1 mL同位素內(nèi)標(biāo)混合液，用1∶1甲醇水定容，最終得到9種孕酮混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。其中，炔諾酮質(zhì)量濃度分別為2.5，5.0，12.5，25.0，50.0和100.0 ng/mL，其余8種孕激素質(zhì)量濃度為1.0，2.0，5.0，10.0，20.0和40.0 ng/mL，同位素內(nèi)標(biāo)中炔諾酮-13C2質(zhì)量濃度為20.0 ng/mL，其余5種內(nèi)標(biāo)均質(zhì)量濃度為10.0 ng/mL。

1.4 樣品前處理

稱取5 g乳粉樣品于離心管中，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液和5 mL 40 ℃溫水，渦旋混勻10 min，加入20 mL乙腈，渦旋提取20 min，于2 ℃以9 500 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，上清液分別用15 mL乙腈飽和的正己烷除脂2次后，將乙腈層轉(zhuǎn)移至潔凈燒杯中，加入75 mL純水，混勻得到樣液。樣液全部過經(jīng)活化后的凈化柱凈化、富集，用6 mL 10%甲醇水溶液淋洗、6 mL甲醇洗脫，洗脫液全部收集于試管中，氮吹至干，用1 mL 1∶1甲醇水溶液溶解殘?jiān)玫綐右?，?jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.5 色譜條件與質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱Waters Acquity BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流速0.300 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇，梯度洗脫：0～8 min，A由50%變?yōu)?6%，8～11 min，A由36%變?yōu)?6%，11～12.5 min，A變?yōu)?%并保持2 min，在0.5 min內(nèi)A由0變?yōu)?0%，并保持2 min，整個洗脫過程耗時17 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

正離子模式電壓3 600 V；鞘氣40 Arb；輔助氣5 Arb；尾吹氣0 Arb；離子傳輸管溫度350 ℃；蒸發(fā)溫度300 ℃；碰撞氣1.5 mTorr；Dwell時間25 ms。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

為使檢測方法能有良好的精密度和靈敏度，需對所有目標(biāo)物質(zhì)及其內(nèi)標(biāo)進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化以獲得最佳質(zhì)譜參數(shù)。稀釋所有孕激素和同位素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成質(zhì)量濃度1 000 ng/mL的工作液用于優(yōu)化質(zhì)譜條件。該工作液通過蠕動泵進(jìn)樣、正離子模式進(jìn)行Q1全掃描，找到對應(yīng)物質(zhì)母離子。對各母離子設(shè)置不同電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣以獲得母離子最高響應(yīng)的參數(shù)，結(jié)合所有母離子參數(shù)確定離子源最終參數(shù)。在此參數(shù)下對母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，設(shè)置碰撞氣體相關(guān)參數(shù)，優(yōu)化得到各母離子對應(yīng)的碎片離子信息及其參數(shù)，選取豐度較高的碎片離子為定性離子和定量離子。質(zhì)譜優(yōu)化結(jié)果見表1。

在所優(yōu)化得到的質(zhì)譜條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的測試，采用1.5中的色譜條件，所有15種目標(biāo)物質(zhì)均有良好的響應(yīng)與分離度，譜圖見圖1。

圖1 孕激素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液提取離子色譜圖

2.2 提取步驟的優(yōu)化

嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，蛋白質(zhì)、脂肪含量較高，為充分提取目標(biāo)9種孕激素，需對蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀去除。乳粉中蛋白質(zhì)沉淀的方式有多種，其中添加有機(jī)試劑沉淀是最為快捷的方法之一。用于沉淀蛋白的有機(jī)試劑有甲醇、乙腈、三氯乙酸、三氯甲烷等，考慮到孕激素的溶解性及化學(xué)試劑的毒害性，僅對甲醇和乙腈進(jìn)行比對試驗(yàn)。乳粉樣品用水溶解后，加入適量甲醇或乙腈，使得有機(jī)試劑與水體積比4∶1，渦旋使溶液充分混合，離心后發(fā)現(xiàn)，加入乙腈的樣品可得到澄清的清液，而加入甲醇的樣品得到的液體相對較為渾濁。經(jīng)后續(xù)稀釋，過凈化柱發(fā)現(xiàn)，加入甲醇的樣品過柱速度慢，且大部分樣品堵塞凈化柱，無法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，而加入乙腈的樣品則可順利過柱。因此選用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

另外，在沉淀蛋白的步驟中，樣液經(jīng)離心后發(fā)現(xiàn)存在一層油脂層，在轉(zhuǎn)移時為避免將油脂層混入其中而增加干擾，試驗(yàn)還添加去除油脂的步驟，即采用飽和乙腈的正己烷溶液對離心后的清液進(jìn)行2次萃取，棄去正己烷層后最終得到待凈化樣液。

2.3 凈化柱的選擇

參考GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》，涉及的9種孕激素可采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱進(jìn)行凈化，但該步驟操作較為繁瑣。HLB柱為親水親脂通用型固相萃取柱，也可考慮使用該柱進(jìn)行凈化樣液。為此比對2種凈化柱的試驗(yàn)效果，結(jié)果如圖2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用HLB固相萃取柱柱能使孕酮和孕酮-d9有更高的回收（峰面積更高），對于除孕酮和孕酮-d9以外的其余8種孕激素和其對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)，采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱和采用HLB固相萃取柱并無顯著差異；另外，數(shù)據(jù)還顯示采用HLB進(jìn)行凈化，9種孕激素和6種同位素內(nèi)標(biāo)的重復(fù)性基本上均優(yōu)于采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱進(jìn)行凈化（HLB的RSD更?。??？紤]到采用ENVI-Carb串聯(lián)氨基柱還需使用到易揮發(fā)的二氯甲烷，因此，選擇HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化、富集。

圖2 不同凈化柱效果比對

2.4 基質(zhì)效應(yīng)考察

為考察基質(zhì)效應(yīng)，對嬰幼兒配方乳粉和試劑空白同步進(jìn)行加標(biāo)，并在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行測試并記錄所有物質(zhì)的峰面積，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒配方乳粉中加標(biāo)所測得的峰面均顯著小于試劑空白加標(biāo)樣品的峰面積，表明嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)具有較強(qiáng)的抑制作用，這可能是由于孕激素極性較小，而通過前處理提取后樣液中含有較多其他弱極性物質(zhì)，在正離子模式下這些雜質(zhì)產(chǎn)生的正離子物質(zhì)與孕激素產(chǎn)生競爭而導(dǎo)致的結(jié)果。因此在定量方式上應(yīng)采用內(nèi)標(biāo)定量才能更加準(zhǔn)確。

2.5 酶解比對試驗(yàn)

在食品中，各種激素在乳粉中可能會以葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)形式和硫酸酯形式存在，因此GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》在對食品進(jìn)行前處理過程中添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對樣品進(jìn)行酶解。然而，有研究表明[30]，乳粉中的雌酮、17β-雌二酮、雌二醇和雌三醇等激素存在葡萄糖醛酸結(jié)合態(tài)形式和硫酸酯形式，而且占比較高，因此添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶可顯著提高乳粉中雌激素測定結(jié)果，然而對于乳粉中的孕激素，有研究表明[31-32]是否添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶進(jìn)行酶解對結(jié)果影響不大。為探究試驗(yàn)方法測定乳粉中的9種孕激素是否需要添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶，設(shè)置酶比對試驗(yàn)：試驗(yàn)組（酶解）+空白組（不酶解）。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 酶解比對試驗(yàn)結(jié)果 單位：μg/kg

結(jié)果顯示，試驗(yàn)組和空白組中，炔諾酮、21α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯這7種孕激素均未檢出（炔諾酮＜1.0 μg/kg，其余6種＜0.4 μg/kg），17α-羥基孕酮和孕酮均有檢出，但17α-羥基孕酮低于定量限，為比對酶解的影響，仍將該孕激素的結(jié)果納入分析。經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行分析，17α-羥基孕酮的試驗(yàn)組和對照組的檢測結(jié)果無顯著性差異（t=1.342，P=0.228＞0.05），孕酮的試驗(yàn)組和對照組檢測結(jié)果也無顯著性差異（t=1.138，P=0.298＞0.05），因此可以認(rèn)為添加β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對試驗(yàn)測定的9種孕激素不會造成顯著性影響。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性、定量限和檢出限

在優(yōu)化后的儀器條件下依次注入混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液3次，以目標(biāo)孕激素與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積之比為縱坐標(biāo)，目標(biāo)孕激素的濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到9種孕激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，9種孕激素在其線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，判定系數(shù)均滿足R2＞0.995。通過在空白樣品中逐步減少加標(biāo)量，平行試驗(yàn)10次，直至所得目標(biāo)物質(zhì)的含量小于rSN=10得到方法定量限，小于rSN=3得到方法檢出限。9種孕激素的線性范圍、檢出限、定量限見表3。

2.6.2 正確度和精密度

方法的正確度通過加標(biāo)回收進(jìn)行考察。對樣品進(jìn)行10次低（SLOD）、3次中（2×SLOD）、3次高（10×SLOD）3個水平進(jìn)行加標(biāo)測試，其中，炔諾酮的加標(biāo)量分別為1，2和10 μg/kg，其余8種孕激素的加標(biāo)量分別為0.4，0.8和4 μg/kg。10次低濃度水平加標(biāo)測試數(shù)據(jù)為精密度測試數(shù)據(jù)，所有濃度水平的加標(biāo)測試數(shù)據(jù)為正確度數(shù)據(jù)。結(jié)果見表3。9種孕激素在各自線性范圍內(nèi)的加標(biāo)回收率及精密度滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求。

2.7 實(shí)際樣品檢測

采用所建立的方法對市售嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。實(shí)際樣品中僅檢出17α-羥基孕酮（含量為0.219 6～0.346 4 μg/kg，低于定量限0.4 μg/kg）及孕酮（含量為3.034 1～3.834 1 μg/kg，高于定量限0.4 μg/kg），炔諾酮、21α-羥基孕酮、甲基炔諾酮、甲羥孕酮、乙酸甲地孕酮、乙酸氯地孕酮、甲羥孕酮乙酸酯均未檢出。檢測結(jié)果在市場調(diào)查范圍以內(nèi)。

3 結(jié)論與討論

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立嬰幼兒配方乳粉中9種孕激素的檢測方法。方法考察樣品前處理中采用不同有機(jī)沉淀劑、不同凈化柱對結(jié)果的影響，以及β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶對檢測結(jié)果的影響。研究表明，采用乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑、HLB固相萃取柱進(jìn)行富集和凈化能獲得良好效果；采用β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶酶解與不進(jìn)行酶解對于這9種孕激素來說并無顯著影響。該方法操作簡單、便捷，同時有良好的準(zhǔn)確性和精密度，定量限低，適用于嬰幼兒配方乳粉中這9種孕激素殘留的測定，可為食品安全監(jiān)控提供參考。