鯉科魚(yú)的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析

杜強(qiáng)，吳林菁*，曾圣，陳飛雄，趙飛，王艷艷

1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所（貴陽(yáng) 550025）；

2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心（貴陽(yáng) 550025）；3.貴州醫(yī)科大學(xué)（貴陽(yáng) 550025）

鯉科魚(yú)（Cyprinidae），屬鯉形目，全世界共有鯉科魚(yú)類210屬3 700種以上。鯉科魚(yú)類分布在底棲或水中層，為卵生，雜食、草食或肉食魚(yú)類，是魚(yú)類中分布最廣、種類最多的一個(gè)科目[1]。我國(guó)自古有養(yǎng)殖鯉科魚(yú)的歷史，特別是在《中華人民共和國(guó)漁業(yè)法》確立“以養(yǎng)為主”的漁業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略以來(lái)，極大地促進(jìn)養(yǎng)殖技術(shù)發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量和出口規(guī)模大幅提高，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口貿(mào)易中占據(jù)重要地位[2]。21世紀(jì)以來(lái)，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，據(jù)2020年《中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》數(shù)據(jù)，鯉科魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量超過(guò)全國(guó)淡水養(yǎng)殖主要魚(yú)類總產(chǎn)量的76%，是中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖主要品種[1]。伴隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，隨之出現(xiàn)品質(zhì)不一等問(wèn)題，這一定程度上制約了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的整體發(fā)展。

水產(chǎn)品的品質(zhì)質(zhì)量分析主要依靠單項(xiàng)指標(biāo)按照國(guó)標(biāo)檢測(cè)分析，該定量分析方法在全面反映其品質(zhì)方面穩(wěn)定性存在不知。相較于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，逐一檢測(cè)分析所需試驗(yàn)試劑較多、操作者判別差異及較長(zhǎng)試驗(yàn)周期，指紋圖譜結(jié)合色譜和光譜等技術(shù)能獲得水產(chǎn)品品化學(xué)成分的特征譜圖，是水產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別、真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣鑒別的有效工具，還可用于生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制，包括追蹤化學(xué)成分的變化、監(jiān)測(cè)各批次產(chǎn)品質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性[3-4]。高效液相色譜是研究指紋圖譜應(yīng)用最廣泛的方法之一，具有分離效能高、分析速度快及儀器自動(dòng)化等特點(diǎn)，被應(yīng)用于大多數(shù)的非揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的化合物的研究，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物藥材品質(zhì)研究中[2-3]，在部分特色水產(chǎn)品[如大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）、馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）和鮑魚(yú)（Abalone）等][4-8]的質(zhì)量控制和產(chǎn)地溯源中也可見(jiàn)報(bào)道。

因此，試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)部分鯉科魚(yú)樣品，建立相關(guān)鯉科魚(yú)HPLC指紋圖譜，并通過(guò)聚類分析、主成分分析對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為水產(chǎn)品質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)）；EYELA FD-1000真空冷凍干燥機(jī)[西崎貿(mào)易（成都）有限公司]；KQ-250B超聲清洗機(jī)（上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司）；BSA323S電子天平（上海皖衡電子儀器有限公司）。

甲醇、乙酸乙酯[均為分析純，科密歐試劑公司（天津）]；乙腈[色譜純，天地公司（美國(guó)）]。試驗(yàn)所用樣品經(jīng)貴州省水產(chǎn)研究所李正友研究員鑒定為鯉科類魚(yú)Cyprinus，分別采集于貴州省內(nèi)遵義、銅仁、畢節(jié)等地（表1）。

表1 鯉科魚(yú)的來(lái)源、相似度

1.2 色譜條件

采用Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫：0～7 min，38% A；7～15 min，38%～81% A；15～35 min，81%～94% A；35～40 min，94%～100% A。在波長(zhǎng)230 nm、進(jìn)樣量20 μL、柱溫30℃、流速0.6 mL/min條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 供試品溶液的制備

將魚(yú)體背部肌肉冷凍干燥24 h后，打粉過(guò)0.250 mm孔徑（60目）篩；稱取1 g肌肉粉末，用乙酸乙酯定容至50 mL，超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液水浴60 ℃揮干溶劑，取10 mL乙腈溶解濾渣，超聲萃取20 min，按5 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.46 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

1.4 方法學(xué)考察

參照以往對(duì)HPLC圖譜研究方法，按表2分別進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目。

表2 HPLC指紋考察項(xiàng)目及結(jié)果

接表2

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜的建立

將記錄好的13批鯉科魚(yú)肌肉供試品（溶液）HPLC圖譜以一定格式（AIA）順序?qū)搿吨兴幧V指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版》[9]軟件，以S1號(hào)樣品的圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間漂移值設(shè)定為0.1，選用中位數(shù)法自動(dòng)匹配譜峰，并生成相關(guān)圖譜（圖1）。所得圖譜中，以共有的15號(hào)色譜峰為參比峰，以其保留時(shí)間為1，選擇峰面積較大峰位較居中的圖譜，確定18個(gè)共有指紋峰，并對(duì)其相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算（SRSD值均＜3.0%），符合指紋圖譜的分析要求[10]，見(jiàn)表3和表4。

圖1 試驗(yàn)鯉科魚(yú)的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜（A）及疊加特征圖譜（B）

表3 試驗(yàn)鯉科魚(yú)指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 試驗(yàn)鯉科魚(yú)指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

接表4

2.2 相似度評(píng)價(jià)

以對(duì)照?qǐng)D譜的相似度為1，分別對(duì)照樣品HPLC圖譜的相似度（結(jié)果見(jiàn)表1）。與對(duì)照組圖譜相比，13批鯉魚(yú)樣品的相似度在0.861～0.990之間，表明各產(chǎn)地鯉魚(yú)品質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，如圖1疊加HPLC特征圖譜所示，試驗(yàn)鯉魚(yú)的主要組成成分基本相同，但各組成成分在含量上有一定的差異。其中樣品S5，S7和S8（貴州惠水）的相似度比較低，另外9個(gè)批次的鯉科魚(yú)相似度較高（相似度＞0.9）。

2.3 聚類分析

聚類分析是一種廣泛應(yīng)用于植物、中藥材、動(dòng)物鑒別、品種分類和質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究分析方法[11-12]，通過(guò)該方法探討對(duì)比試驗(yàn)樣本之間的相關(guān)度及品質(zhì)差異是常用的研究手段。

從指紋圖譜中共有色譜峰代表分析樣品均含有的化學(xué)成分，所在峰面積表示相應(yīng)的成分含量。試驗(yàn)采用組間連接法，通過(guò)余弦距離計(jì)算樣品間距離，在SPSS 19.0軟件中將各樣品共有峰面積作為變量導(dǎo)入，對(duì)13批鯉科魚(yú)樣品運(yùn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖2所示。判別條件距離為25時(shí)，試驗(yàn)所分析的13批鯉科魚(yú)樣品被分為兩類，其中S5，S6，S7，S8和S13聚為一類，其余8個(gè)產(chǎn)地樣品歸為另一類。因此，采用HPLC指紋圖譜，結(jié)合聚類分析和相似度分析可為初步判斷所用鯉科類所屬種類提供參考，但未能區(qū)分不同產(chǎn)地的鯉科魚(yú)。

圖2 鯉科魚(yú)HPLC 指紋圖譜共有峰峰面積的聚類分析

2.4 主成分分析

2.4.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)樣品主成分因子分析，結(jié)果見(jiàn)表5。以特征值＞1為標(biāo)準(zhǔn)，其中前5個(gè)主成分因子的特征值分別為9.025，2.675，2.225，1.287和1.040，方差貢獻(xiàn)率分別為50.141%，14.861%，12.361%，7.152%和5.778%，累積方差貢獻(xiàn)率為90.292%＞90%，說(shuō)明通過(guò)引用前5個(gè)主成分即可代表樣品94%以上的信息，證明該組數(shù)據(jù)有突出的成分可以依據(jù)，適用于主成分分析。故通過(guò)前5個(gè)主成分因子分別對(duì)13批鯉魚(yú)樣品的共有成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表6。由表6可知，主成分因子1可反映成分9，10，11，12，13，14，15，16，17和18的信息，主成分因子2可反映成分1，2，3，4和6的信息，主成分因子3可反映成分2，3和9的信息，主成分因子4可反映成分1，7，8和9的信息，主成分因子5可反映成分4和8的信息。以上述因子作變量繪制載荷圖（圖3）。由圖3可知，載荷圖結(jié)果與初始因子載荷矩陣結(jié)果相同，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的點(diǎn)為主成分因子1，2，3，4和5中權(quán)重值較大的成分。

表5 5個(gè)主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

表6 旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣表

圖3 載荷圖

2.4.2 綜合質(zhì)量評(píng)分

通過(guò)5個(gè)主成分因子對(duì)13批鯉魚(yú)樣品進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表7。主成分因子綜合得分（major factor synthesis score，MFSC）中S9號(hào)鯉魚(yú)樣品（正安縣正南河）最高，該批樣品中1和9～18共11個(gè)主成分的含量相對(duì)較高，相對(duì)而言整體質(zhì)量較好[13]。

表7 主成分因子得分及排序

3 討論

3.1 提取方法的考察

參照水產(chǎn)品指紋圖譜相關(guān)研究，試驗(yàn)對(duì)70%甲醇、甲醇、乙醇等6種提取溶劑進(jìn)行篩選，得出以乙醇提取的樣品溶液圖譜出峰信息量較大，且基線較為平穩(wěn)?？疾旎亓骱统曁崛?種提取方式，結(jié)果表明2種方式得出的色譜圖差異不大，由于回流提取耗時(shí)較長(zhǎng)、步驟較繁瑣，所以選定超聲方法進(jìn)行提?。怀曁崛》矫?，考察30 min（超聲1次），50 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）以及120 min（超聲4次，每次30 min）3個(gè)提取時(shí)間，對(duì)比得出超聲提取80 min（超聲2次，第1次30 min、第2次20 min）的提取效果圖譜信息更完整。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.01%磷酸這4種流動(dòng)相洗脫體系，得出以乙腈-0.01%磷酸體系的效果較好（色譜峰的峰形和分離度較好、色譜峰較多）。比較2種高效液相色譜柱Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）和Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜圖，結(jié)果顯示Diamousil plus C18-A（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱的分離度和峰形效果較好，圖譜基線較平穩(wěn)。分別考察柱溫20～35 ℃時(shí)對(duì)色譜峰分離度的影響，得出柱溫30 ℃時(shí)效果較佳。比較流速0.6～1.2 mL/min對(duì)色譜圖峰形的影響，結(jié)果以0.6 mL/min時(shí)的峰形更對(duì)稱。對(duì)波長(zhǎng)210，230，254，280，310和360 nm進(jìn)行考察，對(duì)比得出在230 nm下圖譜中各色譜峰響應(yīng)值更高，基線較為平穩(wěn)，整體信息更全面，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 相似度、聚類分析及主成分分析討論

來(lái)源于不同產(chǎn)地的鯉科魚(yú)HPLC指紋圖譜有18個(gè)共有峰，從結(jié)果來(lái)看，三者（相似度、得分圖及綜合得分）相互印證，相似度較低的S7樣品（貴州惠水縣養(yǎng)殖的黃河鯉），得分圖中較離群，綜合得分較差，排名靠后。結(jié)合得分圖情況，13批鯉科魚(yú)主成分有一定差異，同一品種不同產(chǎn)地的樣品魚(yú)如S3和S12（野生裂腹魚(yú)）存在一定差異，而同一品種在不同產(chǎn)地的樣品魚(yú)如S1和S9、S5和S13（中華倒刺鲃、清水江鯉）的品質(zhì)相似，同一品種、同一地點(diǎn)的樣品魚(yú)如S5和S13（清水江鯉）相似度存在差異。這與聚類分析結(jié)果有一定差異，原因可能是主成分分析以絕對(duì)峰面積為主，而聚類分析主要是以相對(duì)峰面積為主。當(dāng)然，魚(yú)類品質(zhì)的影響因素是多方面的，比如環(huán)境、餌料、生長(zhǎng)年限等，因此建立水產(chǎn)品特有專屬性和特征性的評(píng)價(jià)體系是很有必要的。綜合此次試驗(yàn)聚類分析和主成分分析的結(jié)果，結(jié)合圖譜峰面積數(shù)據(jù)，可把這13批鯉科魚(yú)分為三類，第一類為S1，S8和S9，第二類為S4，S10，S11和S12，第三類為S2，S3，S5，S6，S7和S13。相對(duì)來(lái)說(shuō)此次試驗(yàn)樣品魚(yú)品質(zhì)質(zhì)量排序?yàn)榈谝活悾镜诙悾镜谌悺?/p>

3.4 鯉科魚(yú)指紋圖譜評(píng)價(jià)

影響水產(chǎn)品品質(zhì)的因素主要包括種質(zhì)特性、養(yǎng)殖環(huán)境、飼喂餌料及生理狀態(tài)[14-15]。鯉科魚(yú)類是我國(guó)養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，而由于遺傳品種及養(yǎng)殖技術(shù)等差異，市場(chǎng)上售賣的鯉科魚(yú)的口感和價(jià)格差異較大，在此過(guò)程中難免出現(xiàn)濫竽充數(shù)，將養(yǎng)殖品作為野生品出售的情況，這嚴(yán)重影響了市場(chǎng)的合理發(fā)展。因此，對(duì)于水產(chǎn)品尤其是特色經(jīng)濟(jì)鯉科魚(yú)類建立一種可行的方法來(lái)判斷區(qū)別魚(yú)類品質(zhì)和質(zhì)量控制很有必要。隨著人類社會(huì)對(duì)水產(chǎn)品需求量的增大及食品安全意識(shí)的加強(qiáng)，水產(chǎn)品品質(zhì)質(zhì)量控制越顯重要。結(jié)合以往關(guān)于有效的食藥品質(zhì)量控制模式研究，指紋圖譜作為因具有科學(xué)的理論依據(jù)和實(shí)踐累積獲得食品藥品質(zhì)量控制業(yè)界的一致認(rèn)可[16-17]。指紋圖譜的優(yōu)勢(shì)在于在主成分未明確情況下，仍可以得到可靠充分的含量類別和數(shù)量信息，從而控制食藥品質(zhì)量[18-19]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[20-25]報(bào)道，不同生長(zhǎng)環(huán)境和養(yǎng)殖方式的水產(chǎn)品在脂肪酸、磷脂等成分含量方面差異明顯，而這些差異在HPLC圖譜中有所體現(xiàn)，這與以往對(duì)其他水產(chǎn)品的研究中得出的結(jié)果相同。所以，HPLC指紋圖譜可以很好地彌補(bǔ)常規(guī)品質(zhì)質(zhì)量控制方法的缺陷，應(yīng)用于水產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)質(zhì)量控制。

4 結(jié)論

試驗(yàn)根據(jù)鯉科魚(yú)肌肉中化學(xué)組成物質(zhì)種類和含量差異建立其指紋圖譜，結(jié)合相似度分析、聚類分析，為鯉科魚(yú)品質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。在特色經(jīng)濟(jì)鯉科魚(yú)的養(yǎng)殖銷售過(guò)程中，能較好地區(qū)分養(yǎng)殖品質(zhì)量，規(guī)范水產(chǎn)品行業(yè)發(fā)展。然而，試驗(yàn)所用的樣品數(shù)和產(chǎn)地來(lái)源相對(duì)較少，具有一定局限性，后續(xù)可通過(guò)擴(kuò)大樣本量，收集全國(guó)各地不同產(chǎn)地樣品，進(jìn)一步完善相關(guān)試驗(yàn)因子，從而對(duì)鯉科魚(yú)的質(zhì)量進(jìn)行更全面的評(píng)價(jià)和控制，更好地為水產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展保駕護(hù)航。