QuEChERS-UPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定植物源保健食品中15種農(nóng)藥殘留

耿熠博，袁利杰*，王祥，郭立凈

1.河南省食品檢驗(yàn)研究院（鄭州 450003）；2.國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品安全快速檢測(cè)與智慧監(jiān)管技術(shù)）（鄭州 450003）；3.特殊食品工程技術(shù)研究中心（鄭州 450003）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)養(yǎng)生保健的需求日益增多，許多保健食品應(yīng)運(yùn)而生[1-3]。植物源保健食品是以藥食同源類中藥材為原料的保健食品，使用較多的原料有決明子、白芍、蘆薈、三七、菊花、枸杞等。

近年來，隨著中藥材種植面積的擴(kuò)大，不少種植戶盲目噴灑化學(xué)農(nóng)藥，亦或者通過土壤、水體轉(zhuǎn)移、富集農(nóng)藥，造成保健食品原料的污染[4-10]。2019年8月16日，國家藥典委發(fā)布《0212藥材和飲片檢定通則公示稿》，規(guī)定禁用33種農(nóng)藥[11]，但是缺少保健食品中農(nóng)藥殘留的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

國內(nèi)外對(duì)農(nóng)藥殘留的文獻(xiàn)報(bào)道中，檢測(cè)方法主要包括液相色譜法（liquid chromatography，LC）[12-14]、氣相色譜法（gas chromatography，GC）[15-18]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）[19-21,28]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[22-25,29]和氣相色譜三重四極桿質(zhì)譜[26-27]。由于植物源保健食品基質(zhì)復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)干擾，試驗(yàn)以市場上常見的6類保健食品作為研究對(duì)象，選擇15種監(jiān)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)較高的農(nóng)藥殘留進(jìn)行研究，以常見的3種劑型，即片劑、膠囊和液體為基質(zhì)，旨在建立一種簡單、快捷的檢測(cè)方法，以滿足大批量樣品檢測(cè)，同時(shí)為植物源保健品農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供方法依據(jù)，為植物源保健食品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

根據(jù)國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則，在河南省不同區(qū)域采集131批次保健食品樣品，包括通便類49批次、減肥類8批次、清咽類35批次、緩解體力疲勞/增強(qiáng)免疫類8批次、降血糖/降血壓類19批次、促進(jìn)消化類12批次，采樣地點(diǎn)為生產(chǎn)企業(yè)的成品庫，流通環(huán)節(jié)的網(wǎng)購、批發(fā)市場、專賣店、藥店、超市和其他。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290-6470超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]；4-16KS高速冷凍離心機(jī)（德國SIGMA）；ME203電子天平、Mettler XS205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UMV-1多管振蕩器（成都萊普科技有限公司）。

1.3 材料與試劑

15種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：3-羥基克百威、吡蟲啉、多菌靈、吡蚜酮、啶蟲脒、涕滅威砜、唑蟲酰胺、滅多威、霜霉威、敵百蟲、甲氨基阿維菌素（100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所）；甲基硫菌靈（97.6%）、硫線磷（98.2%）、噻蟲嗪（99.4%），德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；辛硫磷（99.8%，北京曼哈格生物科技有限公司）。

甲酸銨、甲酸、甲醇（質(zhì)譜純，德國Merk公司）；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉倍半水合物、乙酸鈉（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；0.22 μm濾膜（有機(jī)系，天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

1.4.1.1 片劑

稱取2 g粉碎后試樣于50 mL離心管中，加入10 mL水渦旋，靜置30 min。加入10 mL 1%乙酸-乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，振蕩1 min，加入6 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉，再次劇烈振蕩1 min后，以5 000 r/min離心5 min，移取2 mL上清液至凈化管中[每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mgN-丙基乙二胺（PSA）]，上清液過微孔濾膜，待測(cè)定。

1.4.1.2 膠囊劑（內(nèi)容物）

稱取2 g試樣于50 mL離心管中，加入5 mL水、10 mL 1%乙酸-乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，振蕩1 min后加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉二水合物和0.5 g檸檬酸二鈉倍半水合物，再次振蕩1 min后，以5 000 r/min離心5 min。移取2 mL上清液至凈化管中（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、50 mg C18和50 mg PSA），上清液過微孔濾膜，待測(cè)定。

1.4.1.3 液體

準(zhǔn)確稱取2 g試樣，置于50 mL離心管，用1%乙酸-乙腈定容至10 mL，過微孔濾膜，待測(cè)定。

1.4.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

將15種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇溶解或稀釋，配制成質(zhì)量濃度均為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品混合使用液。選擇不含有目標(biāo)檢測(cè)物的類似樣品，按照試驗(yàn)前處理方法處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用空白基質(zhì)溶液，將其稀釋成質(zhì)量濃度為0.001，0.002，0.005，0.010，0.020，0.050和0.100 μg/mL的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.3 儀器條件

1.4.3.1 色譜條件

色譜柱C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A為2 mmol/L甲酸銨-甲酸水溶液，流動(dòng)相B為2 mmol/L甲酸銨甲醇溶液；梯度洗脫：0～1.5 min，5% B；1.5～3.5 min，5%～30% B；3.5～5.5 min，30%～95% B；5.5～7.5 min，95% B；7.6 min，5% B。

1.4.3.2 質(zhì)譜條件

離子源類型為電噴霧離子源；掃描方式為正離子；電噴霧電壓為正離子5 500 V；離子源溫度350 ℃；霧化氣0.345 MPa。15種農(nóng)藥的質(zhì)譜信息見表1。

接表1

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察Agilent ZOBAX XDB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Phenomenex C18110?（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）3個(gè)品牌的C18色譜柱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離度均比較好，沒有顯著性差異。

分別選取0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸溶液（含2 mmol/L甲酸銨）作為水相，甲醇、乙腈、甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）和乙腈（含2 mmol/L甲酸銨）作為有機(jī)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相為0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸銨）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）時(shí)，各物質(zhì)響應(yīng)強(qiáng)度明顯高于流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液和純有機(jī)相的強(qiáng)度，且峰型拖尾現(xiàn)象得到明顯改善；與乙腈作為有機(jī)相相比，甲醇能在更短時(shí)間內(nèi)使待測(cè)組分得到有效分離。因此，試驗(yàn)選擇0.1%甲酸（含2 mmol/L甲酸銨）溶液和甲醇（含2 mmol/L甲酸銨）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取的離子色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提取的離子色譜圖

提取的離子色譜圖顯示，15種農(nóng)藥的保留時(shí)間處均沒有干擾峰，表明方法專屬性較強(qiáng)。在陰性樣品中添加15種農(nóng)藥，質(zhì)量濃度均為100.00 μg/L，按照1.4.1操作，15種農(nóng)藥提取的離子色譜圖分離良好，單次測(cè)定15種農(nóng)藥在8 min之內(nèi)完成分離。

2.2 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)考察水、甲醇、乙腈、乙醇、1%甲酸-乙腈、1%乙酸-乙腈、1%氨水-乙腈7種提取溶劑體系，通過在植物源保健食品的片劑、膠囊劑和液體3種空白基質(zhì)中加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，計(jì)算回收率，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明膠囊劑和液體劑型的植物源保健食品中乙腈和1%甲酸-乙腈的提取回收率沒有差異，均能達(dá)到80%以上。對(duì)片劑樣品，1%甲酸-乙腈的提取回收率優(yōu)于乙腈的回收率。綜合考慮，選擇1%乙酸-乙腈為提取溶劑。

圖2 不同提取方法對(duì)于片劑保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

2.3 凈化步驟的優(yōu)化

試驗(yàn)考察C18、PSA凈化材料單獨(dú)使用與組合使用對(duì)待測(cè)物回收率的影響。因液體保健食品基質(zhì)相對(duì)較簡單，故不對(duì)其進(jìn)行凈化，僅對(duì)片劑和膠囊的凈化效果進(jìn)行考察。具體步驟：在2.2小節(jié)的優(yōu)化提取條件下，提取完成后以10 000 r/min離心，取上清液至裝有150 mg無水硫酸鎂和不同凈化材料的2 mL離心管中，渦旋離心后過濾膜檢測(cè)，通過計(jì)算15種農(nóng)藥的回收率考察不同凈化材料的吸附情況，結(jié)果見圖3和圖4。結(jié)果顯示，C18與PSA組合使用凈化效果較好，最終選擇50 mg C18+5 mg PSA作為凈化劑。

圖3 不同凈化材料對(duì)于片劑保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

圖4 不同凈化材料對(duì)于膠囊保健食品的15種農(nóng)藥的回收率

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是使用LC-MS/MS檢測(cè)殘留應(yīng)盡量避免的。據(jù)文獻(xiàn)[30-31]報(bào)道，基質(zhì)效應(yīng)案式（1）計(jì)算。

基質(zhì)效=A/B（1）

式中：A為在純?nèi)軇┲修r(nóng)藥的響應(yīng)值；B為樣品基質(zhì)中添加的相同含量農(nóng)藥的響應(yīng)值。

基質(zhì)效應(yīng)為1時(shí)，表示無基質(zhì)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)大于1時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)抑制作用；基質(zhì)效應(yīng)小于1時(shí)，表示樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定存在基質(zhì)增強(qiáng)作用。通過比較15種農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除吡蟲啉外的所有農(nóng)藥均是較為顯著的基質(zhì)抑制效應(yīng)（見表2），基質(zhì)效應(yīng)的值均大于1，因此為消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響，必須采取基質(zhì)標(biāo)曲進(jìn)行校正。

2.5 線性關(guān)系及定量限

以定量子離子的色譜圖峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、定量限見表2。結(jié)果顯示，15種農(nóng)藥在0.001～0.1 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.996，可通過線性方程對(duì)樣品基質(zhì)中農(nóng)藥含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。15種農(nóng)藥方法定量限（limit of quantification，LOQ）按最低質(zhì)量濃度點(diǎn)0.1 μg/mL的響應(yīng)值與空白樣品基質(zhì)中的噪聲響應(yīng)值的10倍計(jì)算，結(jié)果為0.005～0.02 mg/kg，可滿足植物源保健食品中農(nóng)藥的檢測(cè)。

表2 農(nóng)藥線性方程、基質(zhì)效應(yīng)、相關(guān)系數(shù)以及定量限

2.6 方法準(zhǔn)確度和精密度

在不含目標(biāo)檢測(cè)物的消化類保健食品片劑中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別制成0.005，0.100和0.500 mg/kg 3個(gè)水平的空白添加樣品，每個(gè)添加水平做6次平行試驗(yàn)，以加標(biāo)的回收率表示方法的準(zhǔn)確度，按照試驗(yàn)方法處理分析，分別進(jìn)行分析測(cè)定，15種農(nóng)藥在植物源保健品中不同濃度的回收率及精密度見表3。結(jié)果顯示，15種農(nóng)藥在0.005 mg/kg的添加水平下，回收率為82%～107.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，SRSD）為2.9%～9.1%（n=6），在0.1 mg/kg的添加水平下，回收率為83.5%～101.6%，SRSD為3.5%～8.9%（n=6），在0.5 mg/kg的添加水平下，回收率為92.4%～103.4%，SRSD為2.5%～9.7%（n=6）。在不同的添加水平下，樣品基質(zhì)中的重現(xiàn)性與平行性均較好，可滿足多種樣品基質(zhì)大批量檢測(cè)的需求。

表3 農(nóng)藥加標(biāo)回收率及精密度（n=6）

接表3

2.7 樣品分析

按上述檢測(cè)方法，對(duì)6類共計(jì)131批保健食品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示除促進(jìn)消化類保健食品中未檢出農(nóng)藥殘留外，其他5類均有多種農(nóng)藥殘留檢出，檢測(cè)結(jié)果見表4～表6。檢測(cè)結(jié)果顯示：131批次保健食品中有119批次有農(nóng)藥殘留檢出，檢出率為90.8%，檢出農(nóng)藥殘留種類有9種，3-羥基克百威、吡蚜酮、硫線磷、滅多威、涕滅威砜、辛硫磷在6類保健食品中均未檢出，甲氨基阿維菌素檢出率最高，達(dá)到90.8%，其次為甲基硫菌靈，檢出率為33.6%，其他農(nóng)藥殘留檢出率在0.8%～14.5%之間。結(jié)果表明試驗(yàn)方法方便、快速，靈敏度較好，可實(shí)現(xiàn)植物源保健食品中多種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

表4 通便類、減肥類檢測(cè)結(jié)果

表5 清咽類檢測(cè)結(jié)果

表6 降血糖/降血壓類、緩解體力疲勞/增強(qiáng)免疫類檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)通便類、減肥類、清咽類、緩解體力疲勞/增強(qiáng)免疫類、降血糖/降血壓類、促進(jìn)消化類共計(jì)6類131批次保健食品中的15種農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。具體過程：片劑經(jīng)乙腈-乙酸提取、膠囊劑經(jīng)乙腈提取、凈化后經(jīng)超高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜儀定性，外標(biāo)法定量，通過方法驗(yàn)證，符合植物源保健品中的農(nóng)藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。從檢測(cè)結(jié)果來看，植物源保健品中普遍存在農(nóng)藥殘留情況，有119批次檢出農(nóng)藥殘留，檢出率達(dá)90.8%。有64批次檢出2種及以上的農(nóng)藥殘留，其中：有3批次檢出5種農(nóng)藥殘留；有4批次檢出4種農(nóng)藥殘留；有17批次檢出3種農(nóng)藥殘留；40批次檢出2種農(nóng)藥殘留，降血糖、降血壓類檢出的農(nóng)藥殘留種類最多。多菌靈（3.22 mg/kg）、甲基硫菌靈（0.624 mg/kg）、霜霉威（0.459 mg/kg）檢出較高的殘留量，其他含量較低。

該試驗(yàn)質(zhì)譜掃描采用MRM掃描模式，回收率、精確度均良好，可顯著提高靈敏度，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時(shí)測(cè)定，適合植物源保健品中農(nóng)藥殘留的篩查和確證。該方法操作簡單、檢測(cè)速度快，適用于大批量樣品檢測(cè)，可為后續(xù)各類別植物源保健品農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供方法依據(jù)，為植物源保健食品的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。