蜂蜜中酚類物質(zhì)的測(cè)定及其抗氧化活性研究

曾林暉，熊增星，周曉晴，呂小麗，唐麗君*

江西省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證總院食品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院（南昌 330001）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露，與自身分泌物混合后經(jīng)充分釀造形成的天然甜味物質(zhì)[1]，其糖類和水分占蜂蜜質(zhì)量的70%～95%[2-3]，氨基酸、礦物質(zhì)，酚類物質(zhì)占蜂蜜質(zhì)量的5%[4]。由于酚類具有抗菌、消炎、抗氧化等生物學(xué)功能[5-6]，蜂蜜的市場(chǎng)需求越來越大，導(dǎo)致市場(chǎng)上蜂蜜質(zhì)量良莠不齊，因此急需開發(fā)更科學(xué)合理評(píng)定蜂蜜品質(zhì)的方法，以補(bǔ)充傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法的不足。

近年來，酚類物質(zhì)的成分分析、活性研究和溯源等[7-10]成為研究熱點(diǎn)，主要的分析方法有液相色譜法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]和液相色譜-質(zhì)譜法[15-18]。蜂蜜中酚類物質(zhì)的富集凈化方法主要有大孔樹脂吸附法和固相萃取法，大孔樹脂吸附法處理步驟復(fù)雜且不夠環(huán)保[19-20]，對(duì)酚酸類物質(zhì)的保留能力偏弱[21]。Sun等[22]利用離子交換固相萃取柱富集蜂蜜中酚類物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取柱離子強(qiáng)度對(duì)組分的吸附有較大影響，但研究選用的標(biāo)志物太少，評(píng)價(jià)的全面性不足。侯建波等[23]建立16種蜂蜜內(nèi)源性物質(zhì)的分析方法，但缺少對(duì)酚酸類組分的分析，且對(duì)蜂蜜中酚類物質(zhì)的研究缺少對(duì)其抗氧化能力的報(bào)道。

試驗(yàn)考察了5種固相萃取柱對(duì)蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的富集能力差異，建立了HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定蜂蜜中15種常見酚類物質(zhì)的方法，并評(píng)價(jià)了蜂蜜中酚類物質(zhì)的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蜂蜜（江西汪氏蜜蜂園）；沒食子酸（含量99.5%）、綠原酸（含量99.8%）、表兒茶素（含量99.41%）、兒茶素（含量98.1%）、咖啡酸（含量99.97%）、蘆?。ê?8.24%）、p-香豆酸（含量98.58%）、阿魏酸（含量99.21%）、槲皮素（含量98.4%）、芹菜素（含量98.8%）、染料木素（含量99.72%）、山奈酚（含量98.5%）、短葉松素（含量99.98%）、白楊素（含量99.8%）、高良姜素（含量99.98%）：美國(guó)SIGMA公司；DPPH（福州飛勁生物科技有限公司）；FRAP試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；福林酚試劑（上海麥克林生化科技有限公司）；甲醇、甲酸（色譜純，美國(guó)霍尼韋爾公司）；硝酸鋁、醋酸鉀、碳酸鈉（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

Oasis HLB固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis MAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis WAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis MCX固相萃取柱（150 mg/6 mL）、Oasis SAX固相萃取柱（150 mg/6 mL）：美國(guó)沃特世公司。

安捷倫6495A液相色譜-質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；UV-2600紫外可見光分光光度計(jì)（日本島津公司）；ELx800光吸收酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器公司）；SL8離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Quintix 213-1 CN電子分析天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）；Vortex Genie 2多用途渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取約5 mg各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至10 mL，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密吸取一定體積的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容。各物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為1 μg/mL。

1.2.1.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別吸取0.05，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容，得不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品的前處理

1.2.2.1 HLB固相萃取柱富集方法[24]

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0，離心后取上清液過HLB柱（使用前用3 mL甲醇，3 mL蒸餾水（pH 2.0）活化），用4 mL蒸餾水（pH 2.0）淋洗，吹出柱內(nèi)殘液，用5 mL 5%的甲酸-甲醇溶液洗脫后于40 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇溶解，待測(cè)。

1.2.2.2 MAX、SAX、WAX、MCX固相萃取柱富集方法[24]

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 7.0，離心后取上清液過柱[使用前均用3 mL甲醇，3 mL蒸餾水（pH 7.0）活化]，用4 mL蒸餾水（pH 7.0）淋洗，吹出柱內(nèi)殘液，用5 mL 5%的甲酸-甲醇溶液洗脫后于40 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇溶解，待測(cè)。

1.2.2.3 回收率測(cè)定

稱取10 g蜂蜜樣品溶解于50 mL蒸餾水中，加入100 μL質(zhì)量濃度1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照1.2.2.1和1.2.2.2進(jìn)行前處理，按照以下條件進(jìn)液相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.3 分析方法

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱Shim-Pack Gist-HP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL；梯度洗脫程序見表1。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源；掃描模式為負(fù)離子模式；監(jiān)測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；干燥器溫度250 ℃；干燥器流速13 L/min；霧化氣壓力35 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細(xì)管電壓3 500 V；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 酚類物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除試驗(yàn)[25]

以Trolox為陽性對(duì)照，分別測(cè)定5，10，15，20，25和30 μg/mL的Trolox和總黃酮濃度的蜂蜜提取液對(duì)0.2 mmol/L的DPPH自由基清除率。分別確定達(dá)到同一自由基清除率時(shí)Trolox和蜂蜜黃酮的濃度，濃度越低表明其自由基清除能力越強(qiáng)，即抗氧化能力越強(qiáng)。

在96孔板的各檢測(cè)孔內(nèi)分別加入100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔內(nèi)加入100 μL各濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入100 μL各濃度的蜂蜜酚類提取液，混合均勻后經(jīng)37 ℃避光30 min，用酶標(biāo)儀于517 nm處測(cè)定吸光度。按式（1）計(jì)算自由基清除率，以清除率為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)做圖。

式中：A樣品為樣品吸光度；A空白為空白吸光度。

1.2.4.2 FRAP總抗氧化能力測(cè)定[26]

以Trolox為陽性對(duì)照，分別測(cè)定20，40，60，100，200和250 μg/mL的Trolox和總黃酮濃度的蜂蜜提取液對(duì)鐵離子的還原能力。繪制Trolox和蜂蜜黃酮的還原力曲線，同一濃度時(shí)吸光度越大，表示還原力越強(qiáng)。

在96孔板的各檢測(cè)孔內(nèi)分別加入180 μL的FRAP工作液，標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各濃度的蜂蜜酚類提取液，混合均勻后經(jīng)37 ℃避光30 min，用酶標(biāo)儀于593 nm測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，樣品濃度為橫坐標(biāo)作圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件作圖，所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

酚酸和黃酮類化合物由于具有羥基的緣故，在正、負(fù)離子模式下都具有很好的響應(yīng)強(qiáng)度。但是在正離子模式下產(chǎn)生的碎片離子較多，而在負(fù)離子模式下失去氫后產(chǎn)生穩(wěn)定的分子離子峰[M-H]-[27]，因此研究選定負(fù)離子模式。根據(jù)參考文獻(xiàn)[23, 27]，選定各目標(biāo)組分的母離子后，利用目標(biāo)物單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液優(yōu)化碎片離子和碰撞能，優(yōu)化后各目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜柱的選擇

研究Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Shim-Pack Gist-HP（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）和BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）這3種色譜柱的分離情況。結(jié)果表明，目標(biāo)物在RRHD柱上的保留時(shí)間較長(zhǎng)，后續(xù)密集出峰，增大背景噪音，影響后續(xù)測(cè)定。待測(cè)物各組分在Gist-HP柱上均實(shí)現(xiàn)較好分離，特別是對(duì)于兒茶素和表兒茶素這種定量和定性離子都一致的同分異構(gòu)體，分離效果良好，而HILIC柱的分離效果和待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度均弱于Gish-HP柱，可能是HILIC柱的固定相三唑基具有陰離子交換作用，此作用對(duì)酸性化合物有較強(qiáng)的保留能力。因此選擇Gist-HP柱進(jìn)行待測(cè)物的分離，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的總離子流圖見圖1。

2.3 固相萃取柱的優(yōu)化

通過往樣品中加入一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法富集后，利用HPLC-MS/MS測(cè)定各組分含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，不同固相萃取柱對(duì)各組分的預(yù)富集能力差異極大，MCX柱對(duì)黃酮類組分吸附性能較好，對(duì)酚酸的吸附性能較差，其中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、p-香豆酸的回收率分別只有58.1%，34.2%，44.4%和52.4%。離子交換柱的離子強(qiáng)度對(duì)目標(biāo)物的回收率也有顯著影響，SAX柱對(duì)芹菜素、染料木素、山奈酚、白楊素的回收率只有77.4%，44.7%，70.9%和51.8%，遠(yuǎn)低于其他固相萃取柱，具有離子強(qiáng)度越強(qiáng)、回收率越低的特點(diǎn)，且陰離子交換柱對(duì)槲皮素的預(yù)富集能力都不強(qiáng)。HLB柱對(duì)各組分的回收率介于77.5%～117.2%之間，表現(xiàn)出穩(wěn)定的吸附性能和較強(qiáng)的適用性，這是由于HLB柱的吸附劑具有親水和親脂的雙重保留特性[28]，對(duì)酚酸和黃酮都具有良好的吸附效果。這與文獻(xiàn)[29]中報(bào)道的MAX柱凈化效果和HLB柱相當(dāng)?shù)慕Y(jié)論存在差異，可能是由于文獻(xiàn)中用于測(cè)試固相萃取柱回收率的組分較少，不具有普遍代表性，而且凈化過程也存在差異。

圖2 不同固相萃取柱對(duì)15種酚類物質(zhì)回收率的影響

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍和靈敏度

將經(jīng)過前處理的樣品溶液在優(yōu)化后的條件下進(jìn)HPLC-MS/MS分析。以峰面積為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物濃度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各目標(biāo)物在各自濃度范圍內(nèi)，R2值均大于0.995，并分別以信噪比3和10時(shí)，確定待測(cè)組分的檢出限和定量限，結(jié)果如表3所示。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.4.2 回收率和精密度

由于樣品中不同程度地含有被測(cè)組分，且有些含量遠(yuǎn)超過該物質(zhì)的定量限，因此有本底值的組分按照含量的0.5，1和5倍進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，沒有本底值的組分按照定量限的1，2和10倍進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見表4。方法的平均回收率為80.2%～113.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.46%～7.32%，滿足蜂蜜中酚類物質(zhì)的定量分析要求。

表4 蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率試驗(yàn)（n=6）

2.5 抗氧化活性測(cè)定

2.5.1 DPPH自由基清除能力

由圖3可知，DPPH自由基清除率隨著樣品濃度的升高而增高，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系。相同濃度下Trolox的自由基清除能力較蜂蜜黃酮強(qiáng)，DPPH自由基清除率達(dá)到60%時(shí)所需要的Trolox和蜂蜜黃酮的質(zhì)量濃度分別為17.2和24.5 μg/mL，由此可知，蜂蜜黃酮具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，但弱于Trolox。

圖3 Trolox和蜂蜜黃酮對(duì)DPPH·的清除能力

2.5.2 FRAP總抗氧化能力

由圖4可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，吸光度隨著蜂蜜黃酮和Trolox濃度的升高而增大，呈現(xiàn)量效關(guān)系。在相同濃度下，Trolox的還原能力強(qiáng)于蜂蜜黃酮，吸光度達(dá)到0.6時(shí)，所需的Trolox和蜂蜜黃酮的質(zhì)量濃度分別為123.2和182.8 μg/mL，由此可知，蜂蜜黃酮具有良好的總抗氧化能力，但弱于Trolox。

圖4 Trolox和蜂蜜黃酮總抗氧化能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)優(yōu)化固相萃取凈化、色譜分離、質(zhì)譜定性條件，將固相萃取與液相色譜-質(zhì)譜相結(jié)合，建立同時(shí)測(cè)定蜂蜜中15種酚類物質(zhì)的檢測(cè)方法。方法前處理簡(jiǎn)單、快速，可高效測(cè)定蜂蜜中的酚類物質(zhì)，為更科學(xué)合理評(píng)定蜂蜜品質(zhì)提供技術(shù)支撐。利用HLB固相萃取柱富集得到的蜂蜜酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力和FRAP總抗氧化能力，表明蜂蜜是一種優(yōu)良的天然抗氧化資源。