蜂蜜抑菌成分與作用機(jī)制研究進(jìn)展

趙歡，王曉澗,3*，賀曉龍,2，毛超，馬鑫，李雪佳

1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（延安 716000）；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心（延安 716000）；3.陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（延安 716000）

作為一種天然食品，蜂蜜中含有200余種化學(xué)物質(zhì)，其中碳水化合物是蜂蜜主要成分，尤其是果糖、葡糖糖等還原性糖，蜂蜜中也含有蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、維生素（維生素B6、硫胺、煙酸、核黃素和泛酸）、礦物質(zhì)（鈣、銅、鐵、鎂、錳、磷、鉀、鈉和鋅）、酚類化合物和多種揮發(fā)性化合物[1]。各物質(zhì)的相互作用使蜂蜜的黏稠度、色澤、風(fēng)味和顆粒性出現(xiàn)程度性差異，蜂蜜的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與功能保健特性也使其受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注[2]，因此，蜂蜜在醫(yī)療和食品研發(fā)領(lǐng)域具有潛在的市場(chǎng)價(jià)值和巨大的應(yīng)用前景。蜂蜜的組分分析與抗菌活性研究是蜂蜜產(chǎn)品高值利用和開發(fā)的新方向，綜述該方面研究，對(duì)于蜂蜜產(chǎn)品的深入研究和系列抑菌劑的開發(fā)具有重要價(jià)值。

隨著蜂蜜產(chǎn)品的附加值不斷提高，消費(fèi)者對(duì)蜂蜜制品的需求也逐漸提升，隨著耐藥病原體的快速發(fā)展與傳播，藥物抗菌劑的效果逐漸降低，一些微生物對(duì)抗菌劑的耐藥性成為公眾健康與抗生素的共同挑戰(zhàn)，在一些具有抗菌活性的天然產(chǎn)物中提取抗菌物質(zhì)，有利于新型抗菌劑的研發(fā)，蜂蜜中含有豐富的抑菌物質(zhì)，如H2O2、類黃酮、蛋白提取物等[3-4]。綜述蜂蜜中主要化學(xué)組分的生物特性與含量變化，如糖類、蛋白質(zhì)、維生素和礦質(zhì)元素等，也對(duì)蜂蜜中活性物質(zhì)的抑菌機(jī)制，如自由基清除機(jī)制、促炎介質(zhì)調(diào)控機(jī)制、類黃酮構(gòu)效機(jī)制等進(jìn)行探究與展望，旨在更新蜂蜜中活性物質(zhì)的質(zhì)量參數(shù)，為蜂蜜抑菌劑的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，對(duì)蜂蜜制品與蜂蜜提取物的應(yīng)用具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

1 活性成分

糖類是蜂蜜中主要化學(xué)成分，占蜂蜜含量的80%以上，蜂蜜的能量、黏度、顆粒性、飽滿度、結(jié)晶化、分類鑒定及儲(chǔ)存時(shí)間等特性都與糖類物質(zhì)密切相關(guān)。Erban等[5]發(fā)現(xiàn)通過(guò)測(cè)定果糖與葡萄糖（F/G）的比率可以預(yù)測(cè)蜂蜜的結(jié)晶化程度。Kaskoniene等[6]發(fā)現(xiàn)果糖與葡萄糖之間的濃度梯度是進(jìn)行單花蜂蜜分類與鑒別的重要指標(biāo)。蜂蜜在存儲(chǔ)期間糖類會(huì)發(fā)生降解反應(yīng)，戊糖和己糖在緩慢烯醇化的過(guò)程中分解，形成呋喃等不良化合物[7]；可將糖降解物作為蜂蜜熱處理和儲(chǔ)存條件的指標(biāo)。

蜂蜜蛋白質(zhì)和氨基酸來(lái)源于蜜蜂唾液腺和咽部的腺體和花蜜分泌物[8]。蜂蜜中存在很多蛋白酶，如轉(zhuǎn)化酶、α-和β-葡萄糖苷酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶、淀粉酶和葡萄糖氧化酶等[9-10]。淀粉酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶水解α-1, 4-糖苷鍵中的淀粉鏈，產(chǎn)生糊精和低聚糖。β-淀粉酶在末端水解淀粉鏈，導(dǎo)致麥芽糖的形成。蜂蜜中的另一種重要的酶是葡萄糖氧化酶。它將葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖內(nèi)酯，水解為葡萄糖酸。除葡萄糖內(nèi)酯外，葡萄糖氧化酶還產(chǎn)生過(guò)氧化氫，具有抗菌作用[11]。氨基酸占蜂蜜成分的1%左右，其相對(duì)比率取決于蜂蜜（花蜜或蜜露）的來(lái)源。蜂蜜和花粉中最豐富的氨基酸是脯氨酸。脯氨酸主要來(lái)源于蜜蜂將花蜜轉(zhuǎn)化為蜂蜜期間的唾液分泌物。在蜂蜜中，脯氨酸代表50%～85%的氨基酸[12]。

蜂蜜中含有少量維生素，它們主要來(lái)自懸浮的花粉粒。蜂蜜中的維生素包括硫胺（維生素B1）、核黃素（維生素B2）、煙酸（維生素B3）、泛酸（維生素B5）、吡哆醇（維生素B6）、生物素（維生素B8或維生素H）和葉酸（維生素B9）。幾乎所有類型的蜂蜜中都存在維生素C，具有顯著的抗氧化、抗衰老和緩解肌肉酸痛的作用，由于蜂蜜的pH較低，蜂蜜中的維生素能夠長(zhǎng)時(shí)間保存，但是維生素容易受到多種酶促反應(yīng)和光照、溫度等外界因素的影響，因此在不同條件其含量會(huì)發(fā)生顯著變化[13-14]。

2 抑菌物質(zhì)與作用機(jī)制

2.1 H2O2

H2O2在蜂蜜的抗菌活性中起著關(guān)鍵作用，研究表明H2O2的最低抑制質(zhì)量濃度（MIC）在10～1 000 μg/mL的范圍內(nèi)，此外，用CAT處理蜂蜜后，發(fā)現(xiàn)抗菌活性明顯降低，也證明H2O2是主要的抗菌劑。蜂蜜中的H2O2濃度在多個(gè)水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)，沒(méi)有一種單一的化合物或因素可以控制和預(yù)測(cè)H2O2的最終量。早期研究表明，可通過(guò)蜜蜂GOx的合成速率和過(guò)氧化氫酶的分解速率預(yù)測(cè)H2O2的水平，但是最新證據(jù)表明，蜂蜜膠體結(jié)構(gòu)與H2O2密切相關(guān)[15]。

Brudzynski等[16]研究不同蜂蜜的膠體結(jié)構(gòu)、抗菌活性和過(guò)氧化氫生成之間的關(guān)系和過(guò)氧化氫生成與深色、中等和淺色蜂蜜相變點(diǎn)之間的關(guān)系。相變點(diǎn)代表維持蜂蜜兩相膠體構(gòu)象所需的紫外線吸收化合物的臨界閾值濃度。由高濃度的蜂蜜紫外線吸收化合物決定的兩相膠體構(gòu)象促進(jìn)H2O2的產(chǎn)生，而單相膠體狀態(tài)則抑制H2O2的產(chǎn)生。單相稀態(tài)構(gòu)象破壞H2O2分子的穩(wěn)定性，降低其濃度。通過(guò)確定給定蜂蜜中的相變點(diǎn)，可以預(yù)測(cè)過(guò)氧化氫的濃度是否達(dá)到最低抑菌濃度。推測(cè)膠體顆粒及其周圍區(qū)域是一個(gè)反應(yīng)室，允許分子與其他顆粒和周圍糖溶液擴(kuò)散和交換。盡管有研究表明，蜂蜜中的H2O2抑菌效果與葡糖糖氧化酶的合成與分解速率密切相關(guān)，另一部分研究則對(duì)該觀點(diǎn)存在質(zhì)疑，蜂蜜的膠體構(gòu)象與H2O2的抑菌效果呈“倒U形”關(guān)系，蜂蜜的這種構(gòu)象有利于保持較高的H2O2水平，確保其穩(wěn)定性，進(jìn)而保持蜂蜜的抗菌活性，蜂蜜膠體構(gòu)象將對(duì)探究H2O2的生成機(jī)理提供新的理論依據(jù)。

2.2 蛋白提取物（TPE）

通過(guò)親和層析從TPE中獲得5種蛋白質(zhì)組分，命名為F1、F2、F3、F4和F5，蜂蜜每克含有蛋白質(zhì)1.75±0.12 mg，F(xiàn)1中含有0.585±0.200 mg/g，F(xiàn)2、F3、F4和F5分別為0.225±0.020，0.291±0.060，0.330±0.030和0.278±0.020 mg/g。所有蛋白質(zhì)濃度均指蜂蜜的克數(shù)?？偟鞍滋崛∥铮═PE）抑制5種細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)（表3），其中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)TPE的敏感性最高，蜂蜜蛋白質(zhì)組分呈現(xiàn)的廣譜抗菌活性可能是由MRJP（主要蜂王漿蛋白質(zhì)）和蛋白酶等蛋白質(zhì)引起的，這些蛋白質(zhì)可能會(huì)破壞并導(dǎo)致細(xì)菌膜完整性的喪失[17-19]。

大腸桿菌的MIC范圍為50.0±0.1 μg/mL，銅綠假單胞菌的MIC范圍為200.0±1.0 μg/mL，分別是最敏感和最不敏感的細(xì)菌。F1的MIC在抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長(zhǎng)方面比TPE低41～50倍（表3）。對(duì)于鼠傷寒沙門菌、單核增生李斯特菌和銅綠假單胞菌，相同組分的MIC比TPE低2.6～5倍。革蘭陰性菌（如大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門菌）由于其保護(hù)肽聚糖層的外膜，對(duì)抗生素和抗菌蛋白不太敏感。特別是，具有較高M(jìn)IC的銅綠假單胞菌表現(xiàn)出比大腸桿菌高100倍的限制性膜通透性，并具有外排泵，這使其更不易受感染，因此可以避免細(xì)菌死亡，蜂蜜中蛋白質(zhì)組分對(duì)食源性病原體具有非常好的抗菌活性[20-21]。

表1 蜂蜜中不同蛋白質(zhì)組分的最低抑菌濃度

2.3 黃酮類物質(zhì)

蜂蜜中酚類化合物具有抗炎、抗氧化、高效的抑菌活性等作用[22]。這些特性使蜂蜜成為開發(fā)新型抗菌藥物的潛在來(lái)源。但是這些酚類化合物的劑量和成分因地理分布、季節(jié)和植物來(lái)源而異[23]。有效的抗菌活性使蜂蜜成為開發(fā)新的抗真菌治療策略的潛在來(lái)源[24]。

在酚類化合物中黃酮類化合物起主要作用，黃酮類化合物通常被認(rèn)為是控制慢性炎癥性疾病的天然來(lái)源，在傷口愈合方面也有顯著療效，對(duì)慢性傷口組織中預(yù)先存在的微生物起作用，特別是金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌[25]。黃酮類化合物能夠抑制促炎酶（如COX、LOX、iNOS）和促炎介質(zhì)（包括一氧化氮、細(xì)胞因子和趨化因子）。轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB也受類黃酮調(diào)節(jié)，此外還控制多種炎癥介質(zhì)的特異性表達(dá)。

黃酮類化合物根據(jù)芳香環(huán)和雜環(huán)的相互作用、雜環(huán)的氧化狀態(tài)和官能團(tuán)分為不同亞型[26]。最新的分類包括黃酮醇、黃酮、異黃酮、黃烷醇和黃烷酮（表2）。在過(guò)去10年中，含有生物活性化合物的天然食品消費(fèi)量呈逐年上升趨勢(shì)[27]。蜂蜜是酚類化合物種類繁多的食品之一。Bergamo等[28]證實(shí)山奈酚和槲皮素比芹菜素和白楊素具有更強(qiáng)的還原鐵（III）和清除ABTS自由基的能力，這與C3位置上存在羥基有關(guān)。

表2 蜂蜜中常見的黃酮類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)及質(zhì)量參數(shù)

2.3.1 自由基清除作用機(jī)制

當(dāng)機(jī)體細(xì)胞和組織不斷受到生理氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的或外源性因素誘導(dǎo)的自由基和活性氧損傷威脅時(shí)。活性氧可能導(dǎo)致從炎癥損傷到癌癥的大量疾病[29]。蜂蜜中類黃酮以多種方式發(fā)揮抑菌作用，包括螯合參與自由基形成的過(guò)渡金屬、直接清除活性氧、抑制產(chǎn)生超氧陰離子的酶及通過(guò)減少烷基和過(guò)氧自由基防止過(guò)氧化過(guò)程。王倩等[30]通過(guò)鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP）和自由基清除（ABTS）方法評(píng)估山奈酚、芹菜素、槲皮素和白楊素的抑菌活性。山奈酚和槲皮素比芹菜素和白楊素具有更強(qiáng)的還原鐵（III）和清除ABTS自由基的能力，這與C3位置上存在羥基有關(guān)。Li等[31]則將芹菜素更強(qiáng)的抑菌活性歸因于DPPH和ABTS測(cè)定后C4位置上的羥基。在最新用DPPH方法進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，槲皮素的抑菌作用（9 μmol/L抑制率為50%）高于其糖苷（12 μmol/L抑制率為50%）。Ibrahim等[32]研究6種黃酮類化合物作為5-LOX抑制劑的作用，其中2種發(fā)現(xiàn)于蜂蜜中。槲皮素和柚皮素在3.7和2.3 μmol/L時(shí)分別抑制50%的酶活性。應(yīng)結(jié)合好氧細(xì)菌的生活活性，對(duì)類黃酮的清除活性氧機(jī)制做進(jìn)一步深入研究，若將其機(jī)理用于其他食品的加工儲(chǔ)存過(guò)程中，能有助于延緩產(chǎn)品保質(zhì)期。

2.3.2 促炎介質(zhì)調(diào)節(jié)機(jī)制

血清蛋白和一些特定細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）從血液遷移到炎癥組織會(huì)導(dǎo)致包括炎癥在內(nèi)的系列疾病發(fā)生。類黃酮可能通過(guò)降低不同促炎細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)發(fā)揮作用，包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL-1β）、白細(xì)胞介素（IL-1β）、IL-2、IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）。促炎和抗炎細(xì)胞因子（如IL-10、IL-4和TGF-β）之間的平衡是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵。因此，細(xì)胞因子是類黃酮等新型抗炎劑的研究靶點(diǎn)[33]。在抗炎潛力評(píng)估期間，優(yōu)先考慮黃酮類化合物，木犀草素和槲皮素，其次是蘆丁。

類黃酮的抗炎潛力可能與調(diào)節(jié)促炎基因表達(dá)的能力有關(guān)，這些基因控制多種介質(zhì)的產(chǎn)生，如一氧化氮、細(xì)胞因子和促炎酶。一些免疫系統(tǒng)因子，包括核因子（NF-κB）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）、叉頭盒P3（FoxP3）、T盒轉(zhuǎn)錄[34]。蜂蜜中參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的細(xì)胞及由細(xì)胞產(chǎn)生的控制炎癥過(guò)程的介質(zhì)（損傷后的促炎作用、組織破壞和修復(fù)組織的抗炎作用）這一過(guò)程為黃酮類化合物抑菌效果反應(yīng)提供新證據(jù)。

2.3.3 類黃酮構(gòu)效機(jī)制

類黃酮通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮其抑菌抗炎作用，在多項(xiàng)研究中，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)與某些炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)之間的關(guān)系已建立。花生四烯酸級(jí)聯(lián)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)酶是炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵。黃酮類化合物可能作為激酶的競(jìng)爭(zhēng)底物。Middleton等[35]證實(shí)槲皮素是1種對(duì)三磷酸底物（如ATP和GTP）具有競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑。木犀草素競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷蛋白激酶C和蛋白酪氨酸激酶催化肽上的ATP底物結(jié)合位點(diǎn)。糖苷類黃酮和甲氧基對(duì)酶抑制效果較差。

磷脂酶A2（PLA2）也是黃酮類化合物靶向的重要炎癥介質(zhì)。A環(huán)和C環(huán)的共價(jià)性對(duì)PLA2抑制起決定性作用[36]。環(huán)氧化酶（COX）和脂氧化酶（LOX）更容易被多羥基類黃酮抑制。對(duì)于LOX，B環(huán)中的兒茶酚基是酶抑制的決定因素[37]。O’Leary等[38]評(píng)估黃酮類化合物對(duì)COX-2轉(zhuǎn)錄的活性，并報(bào)道槲皮素C3位置上的游離羥基將有助于COX-2抑制，而槲皮素-3-葡萄糖醛酸由于葡萄糖醛酸處于相同位置而效果較差。Raso等[39]也建議將槲皮素和芹菜素作為COX-2抑制劑。Mutoh等[40]評(píng)估9種黃酮類化合物對(duì)COX-2轉(zhuǎn)錄的活性，結(jié)果顯示B環(huán)C3’和C4’位置的游離羥基增加對(duì)酶的抑制。Honmore等[41]對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行分子對(duì)接，表明高良姜素對(duì)COX-2具有很高的親和力，因此可以探索作為這種酶的選擇性抑制劑。Choi等[42]通過(guò)分子對(duì)接，證實(shí)白楊素是COX-2的選擇性抑制劑。Lee等[43]闡釋山奈酚抑制激酶的分子機(jī)制。Yadavalli等[44]評(píng)估對(duì)LOX的抑制作用，表兒茶素沒(méi)食子酸酯與受試黃酮類化合物（兒茶素、表兒茶素和二氫槲皮素）中的目標(biāo)酶結(jié)合能力最好。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

利用蜂蜜提取物治療耐藥菌感染具有多種優(yōu)勢(shì)：不易引起病菌耐藥共性、較中藥復(fù)方而言，蜂蜜化學(xué)組分更明確；蜂蜜中部分物質(zhì)如H2O2、類黃酮、蛋白提取物等被證實(shí)具有較高抑菌活性，且具有較強(qiáng)光譜長(zhǎng)效性，抑菌譜廣泛；抑菌機(jī)制多樣化，可協(xié)同醫(yī)藥類抗菌劑，增效對(duì)病菌耐藥性的調(diào)控；化學(xué)穩(wěn)定性好，提取加工較易且安全無(wú)毒；清除自由基、防止過(guò)氧化、改善藥物作用靶點(diǎn)，降低促炎和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)。

蜂蜜作為一種天然食品，在功能保健領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景，對(duì)蜂蜜的主要化學(xué)組分、抑菌活性物質(zhì)、抑菌機(jī)制進(jìn)行綜述，為利用蜂蜜提取物開發(fā)系列安全高效蜂蜜的天然藥物提供理論支撐，為結(jié)核病、破傷風(fēng)、流感、肝炎等相關(guān)傳染病的治療途徑提供最新數(shù)據(jù)幫助，并未合成抗菌藥物耐藥性中的微生物適應(yīng)問(wèn)題提供新的研究進(jìn)展。