基于電子鼻探究不同發(fā)酵劑對凝固型酸羊乳的影響

劉亞文，劉珊珊，石艷，韓金蓮，白麗娟*

1.錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院 遼寧省肉類加工與質(zhì)量安全控制專業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心（錦州 121000）；

2.錦州市檢驗檢測認(rèn)證中心（錦州 121000）；3.盤錦宋大房食品有限公司（盤錦 124000）

羊奶以其營養(yǎng)豐富、容易吸收等優(yōu)點被視為乳品中的精品，被譽為“奶中之王”，同時也是世界上公認(rèn)的最接近人乳的可開發(fā)乳品[1]。并且山羊奶還具有更好的消化率、低過敏性、更高的緩沖能力和更高的pH[2]。雖然鮮羊奶有多種優(yōu)點，但其膻味導(dǎo)致不少消費者對鮮羊奶制品望而卻步[3]。如果將羊奶經(jīng)過發(fā)酵制成酸奶產(chǎn)品，不僅在一定程度上弱化了羊奶的膻味，更好地提升了羊奶的口感，同時更優(yōu)化了鮮羊奶的營養(yǎng)價值[4]。蘇偉麗等[5]通過設(shè)置不同的變量成功探究出生產(chǎn)低膻味酸羊奶的最佳工藝條件。陳合等[6]從牛奶發(fā)酵劑中篩選出適用于羊奶發(fā)酵的菌種，并完成對凝固型酸羊奶發(fā)酵工藝的優(yōu)化。李瑩等[7]通過響應(yīng)曲面法對生產(chǎn)山羊酸奶的配方與發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。張富新[8]通過大量試驗證實了羊奶發(fā)酵成酸奶是可行的。山羊乳酸奶由于具有較高的營養(yǎng)成分和生物活性肽，可提供極好的健康價值[9]，山羊奶具有開發(fā)為功能性食品的潛力，特別是針對炎癥性腸病和消化不良人群[10]。目前國際上羊奶產(chǎn)品研究開發(fā)較為廣泛，而我國羊奶加工以奶粉及液態(tài)奶居多[11]。市場上對酸牛奶的推廣較多，酸羊奶的開發(fā)還有很大空間，所以酸羊奶的研究開發(fā)具有重要意義，能更好地彌補羊奶市場的空缺，是一片值得推進的綠色發(fā)展新領(lǐng)域。電子鼻技術(shù)可以監(jiān)測羊奶發(fā)酵前后不同階段揮發(fā)性成分的變化，為進一步研究發(fā)酵羊奶能夠降低羊奶膻味的機理奠定基礎(chǔ)[12]。

該試驗采用3種發(fā)酵劑（YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900）分別發(fā)酵成以鮮羊乳為原料的凝固型酸羊乳，通過不同發(fā)酵劑添加量、加糖量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的單因素試驗及響應(yīng)面設(shè)計來優(yōu)化凝固型酸羊乳的工藝參數(shù)，并利用電子鼻對酸羊乳的風(fēng)味穩(wěn)定性進行檢測，以期獲得凝固型酸羊乳生產(chǎn)的最優(yōu)發(fā)酵劑及工藝參數(shù)，用于工業(yè)生產(chǎn)，彌補市場空缺。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羊奶（九羊純羊奶）；白砂糖（市售，一級）；發(fā)酵劑（丹尼斯克菌種，型號YO-MIX883，YOMIX300和YO-MIX900）；氫氧化鈉（濟南盈動化工有限公司）；酚酞指示劑（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；PEN3型電子鼻（德國AIRDENSE公司）；BCD-215KS冰箱（青島海爾股份有限公司）；C21-Simple101美的電磁爐（美的集團有限公司）；SWCJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰有限公司）；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海-恒科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 凝固型酸羊乳的制備

發(fā)酵劑的預(yù)處理：將3種發(fā)酵劑活化，并以4%的添加量分別接種到滅菌后的鮮羊乳中，在43±1 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 h，置于4 ℃或5 ℃冰箱備用。

成品羊奶→加熱（75±1 ℃）→配料混合（6%白砂糖）→殺菌（95 ℃，5 min）→冷卻→接種發(fā)酵劑（4%）→灌裝→發(fā)酵（43±1 ℃，3～4 h）→冷卻→放入冰箱后發(fā)酵→成品

1.2.2 不同發(fā)酵條件對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響

在單因素試驗中，將制備的YO-MIX883、YOMIX300、YO-MIX900發(fā)酵劑分別以2%，3%，4%，5%和6%的接種量分別接種到加糖量為2%，4%，6%，8%和10%的殺菌過后的羊乳中，再分別放入39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h。將上述各項單因素試驗后形成的凝固型酸羊乳在4 ℃冰箱后熟，依次進行感官評定和酸度檢測，探究不同發(fā)酵劑添加量、加糖量、發(fā)酵時間和溫度對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)定發(fā)酵劑接種量、加糖量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為4個因素，分別取3個水平，以酸羊乳的感官評分為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法對四因素三水平進行試驗設(shè)計，響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

1.2.4 酸羊乳的感官評價標(biāo)準(zhǔn)

邀請10名食品評審員對制得的酸羊乳進行品嘗，對產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤、口感和組織狀態(tài)4個方面進行評價計分。

表2 酸羊奶感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 電子鼻的檢測

分別量取10 mL發(fā)酵后在4 ℃冰箱存放1，4，7，10和13 d的樣品置于30 mL樣品瓶中，用封口膜封口，在溫度30 ℃條件下靜置5 min后直接將進樣針頭插入樣品瓶，采用頂空吸氣法進行電子鼻分析試驗。電子鼻測定參數(shù)：清洗時間120 s、歸零時間5 s、預(yù)進樣時間5 s、測定時間60 s[13-14]、載氣流速300 mL/min。每個樣品測定3次。電子鼻各傳感器信息見表3。

表3 電子鼻傳感器所對應(yīng)的氣味類型

1.2.6 凝固型羊奶酸奶酸度的測定

羊奶酸奶酸度的測定按 GB 5409—85方法[15]，酸度用吉爾涅爾度（°T）表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先行方差齊性檢驗，依條件行t檢驗、方差分析等，以P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義，繪圖采用Excel 2010。主成分分析法（Principal Component Analysis，PCA）、線性判別分析法（Linear Discriminant Analysis，LDA）[16]，用Winmuster軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵條件對凝固型酸羊乳品質(zhì)的影響

2.1.1 不同發(fā)酵劑接種量對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響

將3種發(fā)酵劑分別以2%，3%，4%，5%和6%的接種量接種到加糖量為6%的殺菌過后的羊乳中，在43℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 h，發(fā)酵至凝固后進行感官評定，隨后進行滴定酸度的測定，重復(fù)3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖1所示。

圖1 不同發(fā)酵劑接種量對凝固型酸羊乳感官及酸度的影響

從圖1可知：YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900三種型號的發(fā)酵劑均在接種量為4%時感官評分可達到較高分，MIX900最高達90分，發(fā)酵后的凝固型酸羊乳的風(fēng)味醇正、組織結(jié)構(gòu)細(xì)膩。在發(fā)酵劑過少的情況下酸甜比上會造成失衡，導(dǎo)致口感方面不被大眾所接受；在發(fā)酵劑過多的情況下會造成組織狀態(tài)方面的問題，例如乳清析出的狀況。并且從圖中柱狀圖中可以看出酸度隨著接種量的增大而增高，這可能是因為發(fā)酵劑接種量加大導(dǎo)致乳酸菌增多，在接種量4%時酸度84°T為酸奶的最宜酸度。綜上所述選用MIX900發(fā)酵劑、接種量為4%時最為適宜，并且試驗中發(fā)現(xiàn)可以通過菌種的發(fā)酵可消除羊乳中固有的膻味。從全圖中可以看到三種發(fā)酵劑對產(chǎn)品的影響依次為YO-MIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.2 不同加糖量對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響

將3種發(fā)酵劑分別以4%的接種量接種于加糖量分別為2%，4%，6%，8%和10%的殺菌過后的羊乳中，在43 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 h，發(fā)酵至凝固后進行感官評定，隨后進行滴定酸度的測定，重復(fù)3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖2所示。

從圖2可知，感官評分分?jǐn)?shù)變化呈先上升后下降的趨勢，在加糖量大于6%時酸度得到了明顯降低，但凝固時間延長，這可能是因為糖影響了菌種的生長繁殖。因此加糖量為6%時凝固型酸羊乳的口感及風(fēng)味最佳，酸甜比例適宜。并且從全圖中可以看到三種發(fā)酵劑對產(chǎn)品的影響依次為YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

2.1.3 不同發(fā)酵溫度對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響

將3種發(fā)酵劑分別以4%的量接種量，6%加糖量，依次在39，41，43，45和47 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵4 h至凝固進行感官評分，隨后進行滴定酸度的測定，重復(fù)3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖3所示。

從圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高感官評分也隨之升高，整體呈先上升后下降的趨勢，這是因為發(fā)酵溫度可以直接影響酸羊乳發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)，在發(fā)酵溫度過低時會造成凝乳狀態(tài)不佳，乳清析出，組織狀態(tài)粗糙的問題。當(dāng)發(fā)酵溫度過低時也會造成乳清析出的問題，并且從上述柱形圖中可以看出酸度值隨著溫度的上升而上升，這是由于在高溫條件下乳酸會增多的原因，從而也是導(dǎo)致酸甜比失衡，感官評分降低的重要原因。圖中顯示43 ℃時感官評分最高，因此選用發(fā)酵溫度43 ℃對于凝固型酸羊乳發(fā)酵較為適宜，并且從全圖中可以看到三種發(fā)酵劑對產(chǎn)品的影響依次為YOMIX900＞YO-MIX300＞YO-MIX883。

2.1.4 不同發(fā)酵時間對凝固型酸羊乳風(fēng)味的影響

將3種發(fā)酵劑分別以4%的接種量，6%加糖量，在43 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵的條件下，依次在3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h發(fā)酵時間下進行感官評分，隨后進行滴定酸度的測定，重復(fù)3次試驗。感觀評分及酸度變化如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵時間、不同發(fā)酵劑對樣品感官及酸度的影響

發(fā)酵時間對產(chǎn)品整體品質(zhì)有著極大的影響，時間過長或過短都會造成產(chǎn)品風(fēng)味的改變。從圖4可知，在發(fā)酵時間為4 h時感官評分達到最高值，因此選用發(fā)酵時間4 h進凝固型酸羊乳的制備，且從全圖中可以看到三種發(fā)酵劑對產(chǎn)品的影響依次為YO-MIX900＞YOMIX300＞YO-MIX883。

通過上述分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種發(fā)酵劑中YO-MIX900更為突出，相應(yīng)的感官評分也優(yōu)于YO-MIX300和YOMIX883，并且酸奶的標(biāo)準(zhǔn)酸度處于82～85 °T左右，所以發(fā)酵劑YO-MIX900為最適發(fā)酵劑，此條件下凝固型酸羊乳酸甜適口，口感細(xì)膩無顆粒，組織表面光滑。因此后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗選用發(fā)酵劑YO-MIX900進行發(fā)酵并對其做出分析。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化凝固型酸羊乳試驗結(jié)果與分析

為確定凝固型酸羊乳的工藝參數(shù)，以發(fā)酵劑YOMIX900的接種量（A）、加糖量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為試驗因素，利用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，主要以感官評分為響應(yīng)值（Y）。分析方案及結(jié)果如表4所示：

根據(jù)表4響應(yīng)面分析結(jié)果，用軟件Design-Expert 8.0.6進行分析，得出結(jié)果，感官得分與各項因素的二次方程模型：Y=95.40+0.33×A+1.00×B+0.083×C-1.58×D-0.75×A×B-2.00×A×C+1.25×A×D-1.00×B×C+0.75×B×D+0.25×C×D-7.62×A2-7.62×B2-7.99×C2-6.24×D2。

表4 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

根據(jù)表5可知，整體模型的P＜0.01，表明該模型顯著水平到達最優(yōu)，并且其中的失擬項不顯著，并且R-Squared值為0.982 3，AdjR-Squared值0.964 6，都接近值1，Adeq Precision的值22.238大于4，說明該模型合理，可以看出各項因素與響應(yīng)值之間的有較高的真實性。由F值可知，4個因素對凝固型酸羊乳品質(zhì)的影響最大的是發(fā)酵時間，接下來依次的順序為加糖量、發(fā)酵劑接種量，最后是發(fā)酵溫度。

表5 回歸方程方差分析

根據(jù)回歸方程的分析，做出相應(yīng)的3D曲面圖和等線圖，考察4個因素兩兩進行交互所擬合出的曲面圖形狀，進而分析對凝固型酸羊乳感官得分的影響。

圖7 發(fā)酵劑接種量與發(fā)酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應(yīng)曲面圖及等高線

圖8 加糖量與發(fā)酵溫度對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應(yīng)曲面圖及等高線

圖9 加糖量與發(fā)酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應(yīng)曲面圖及等高線

響應(yīng)面的坡度決定了兩兩因素交互作用對產(chǎn)品感官的顯著與否，坡度與顯著性呈正向相關(guān)，坡度越陡峭越顯著。等高線圖表示兩個因素之間的交互作用，呈橢圓時表示交互作用很大。試驗結(jié)果均符合以上特點。圖5～圖10表明：當(dāng)發(fā)酵劑接種量、加糖量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間的逐漸增加時，感官評分均呈先升高后下降的趨勢，并且可以看出因素發(fā)酵時間對凝固型酸羊乳的影響最大。結(jié)合響應(yīng)面分析結(jié)果可知，最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵劑接種量4%、加糖量6%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時間4 h。對此條件下發(fā)酵出的凝固型酸羊乳進行感官評定，經(jīng)過專業(yè)感官評價人員給分，重復(fù)3次，感官評價平均分?jǐn)?shù)可以達到95分，相比較其他試驗組合評分位于前列。并且該條件下制成凝固型酸羊乳的成品經(jīng)過品嘗之后受大眾喜歡。說明響應(yīng)面優(yōu)化后方案的可行性，但考慮后期的實際生產(chǎn)，為此進行驗證試驗，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果得出的最佳工藝參數(shù)進行試驗，重復(fù)3次做平行試驗，經(jīng)過感官評定小組評定，重復(fù)3次的平均分?jǐn)?shù)可以達到95分，與響應(yīng)面軟件給出的預(yù)測值95.528相對偏差小于1%，表明該試驗的響應(yīng)面優(yōu)化試驗合理。

圖5 發(fā)酵劑接種量與加糖量對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應(yīng)曲面圖及等高線

圖10 發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對凝固型酸羊乳感官評分影響的響應(yīng)曲面圖及等高線

2.3 利用電子鼻監(jiān)測酸羊乳風(fēng)味的變化

2.3.1 酸羊乳在保存中PCA主成分分析

在發(fā)酵劑YO-MIX900接種量4%，加糖量6%，發(fā)酵溫度43 ℃，發(fā)酵時間4 h條件下，將發(fā)酵好的酸羊乳，于4 ℃冷藏貯存13 d，分別在1，4，7，10和13 d利用電子鼻進行測定。圖中每個橢圓代表羊乳發(fā)酵不同時間的數(shù)據(jù)采集點。

圖11是YO-MIX900發(fā)酵劑制得的酸羊乳在4 ℃貯藏1～13 d過程中揮發(fā)性成分的PCA主成分分析圖。由圖11可知：第一主成分區(qū)分貢獻率為93.38%，第二主成分區(qū)分貢獻率為4.49%，兩個主成分貢獻率的和為97.87%，大于85%，所以這兩個主成分已經(jīng)很好代表了樣品的主要信息特征。從圖11主成分PC1和PC2兩個主軸上來看，第1，第7和第13天的樣本比較近，第4天與第10天樣本較遠(yuǎn)，各個樣本能夠明顯區(qū)分。說明電子鼻能較好區(qū)分貯存第1～第13天YO-MIX900發(fā)酵劑發(fā)酵的樣本酸羊乳，但是整體風(fēng)味相差不大，說明產(chǎn)品貯存期間比較穩(wěn)定。

圖11 YO-MIX900發(fā)酵劑酸羊乳5 ℃保存1～13 d PCA主成分貢獻率

2.3.2 酸羊乳在保存中LDA線性判別分析

圖12是YO-MIX900發(fā)酵劑制得的酸羊乳在4 ℃貯藏1～13 d過程中揮發(fā)性成分的LDA主成分分析圖。由圖12可知：第一主成分區(qū)分貢獻率為79.09%，第二主成分區(qū)分貢獻率為11.79%，兩個主成分貢獻率的和為90.88%，大于85%。從圖12可知：第4，第7和第10天風(fēng)味差異明顯，第1和第13天樣本相近，說明YOMIX900發(fā)酵劑發(fā)酵的酸羊乳在保藏過程中揮發(fā)性成分（硫化氫、有機芳香硫化物和氮氧化合物為主）變化差別不是很大，因此風(fēng)味雖有變化但不是特別明顯，即在保質(zhì)期內(nèi)無明顯變化，與風(fēng)味變化不顯著的理論相吻合。綜上分析發(fā)現(xiàn)YO-MIX900發(fā)酵的酸羊奶在保存期內(nèi)風(fēng)味變化不顯著，氣味比較穩(wěn)定，是比較理想的發(fā)酵劑。

圖12 YO-MIX900發(fā)酵劑酸羊乳5 ℃保存1～13 d LDA分析

3 結(jié)論

通過使用YO-MIX883、YO-MIX300、YOMIX900發(fā)酵劑，在不同發(fā)酵條件下發(fā)酵制得酸羊乳，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化試驗后并對酸羊乳在感官特性、貯存中風(fēng)味變化以及發(fā)酵后酸羊乳酸度檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵劑YO-MIX900在接種量4%、加糖量6%、發(fā)酵溫度43 ℃、發(fā)酵時間4 h獲得的酸羊乳風(fēng)味穩(wěn)定、酸味適中，且利用電子鼻對酸羊乳風(fēng)味進行檢測，揮發(fā)性物質(zhì)變化小，檢測結(jié)果較優(yōu)，感官評定結(jié)果較佳，因此YO-MIX900是凝固型酸羊乳較理想的發(fā)酵劑，可用于工業(yè)生產(chǎn)。當(dāng)前我國各地區(qū)出臺了各項奶業(yè)振興計劃，而羊奶是最適宜我國國民飲用的乳品，并且加工技術(shù)逐漸成熟，大有增長的勢頭，所以羊奶產(chǎn)業(yè)擁有光明的前景，相信將來羊奶開發(fā)產(chǎn)品可迎來空前的發(fā)展前景。