熱處理方式對對蝦質(zhì)量指標及蛋白體外消化性的影響

王軍，梁小蝶，劉婧，黃浩麟，王忠合*

韓山師范學院生命科學與食品工程學院（潮州 521041）

對蝦種類繁多，在我國沿海地區(qū)養(yǎng)殖和捕撈的主要有凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、斑節(jié)對蝦（Penaeus momodon）、日本對蝦（Marsupenaeus japonicus）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、墨吉對蝦（Penaeus merguiensis）、鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）、長毛對蝦（Penaeus penicillatus）和、短溝對蝦（Penaeus semisulcatus），它們因肉質(zhì)肥美，營養(yǎng)豐富，脂肪含量較少而蛋白質(zhì)和氨基酸含量高，深受廣大消費者的喜愛[1]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活質(zhì)量的提高，人們對蝦的消費量日益增加，而對于其加工烹制后的品質(zhì)變化等方面的研究漸漸受到重視。日常生活中對蝦烹飪方式有汽蒸、水煮和油炸等，不同的烹飪處理方式制作出的對蝦口感變化和營養(yǎng)價值的損失也不盡相同[2-3]。

在食品加工中，熱處理對蛋白質(zhì)的影響較大，影響程度取決于加熱時間、溫度、濕度及有無糖類等因素，在適宜的加熱條件下蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性而造成肽鏈的次級鍵斷裂，使原來折疊部分的肽鏈松散，容易受到消化酶的作用，從而提高消化率。同時，適宜的食品熱加工處理還可破壞抗營養(yǎng)因子和降低蛋白的過敏性等。但過度加熱又會導致氨基酸氧化、酰胺鍵交換等而難以被消化酶水解，造成消化率下降，甚至食品的風味也隨之降低。通常認為，食品中蛋白質(zhì)的功能特性（特別是消化性）與食品的加工方法和加工程度有密切關系[4-5]。試驗選取凡納濱對蝦為研究對象，采用水煮、汽蒸、油炸、微波等方式處理，測定其質(zhì)量指標，并進行體外消化試驗分析其蛋白消化率，鑒定模擬體外胃腸消化后產(chǎn)物中的肽段變化，以期為對蝦的熱處理及蛋白質(zhì)消化率評定提供一定理論指導。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

EASY-nLC 1200納升級液相色譜、Q Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；ZX4漩渦振蕩器（意大利VELP公司）；IKA T25高剪切均質(zhì)機（IKA公司）；Direct-Q5超純水器（美國Millipore公司）；Z326K高速冷凍離心機（德國哈默公司）；JY3002電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BWS-0505恒溫水槽與水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；AS系列超聲波清洗機（蘇州江東精密儀器有限公司）；M1-L213B微波爐（廣東美的電器制造有限公司）；WF0-710W送風定溫干燥箱（上海愛朗儀器有限公司）；UV-2800紫外可見分光光度計（上海安亭科學儀器廠）；FDU-2110冷凍干燥機（東京理化儀器）；TQZ-312恒溫搖床（上海精宏實驗設備有限公司）；Oasis HLB固相萃取柱（美國Waters公司）；色差計JZ-350色彩色差計（深圳市金準儀器設備有限公司）；MD-720A型鹵素水分測定儀（廈門群隆儀器有限公司）。

1.2 試劑與樣品

甲醇、乙腈、甲酸（質(zhì)譜級，購于默克股份有限公司）；考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白、胃蛋白酶（1∶3 000）、水楊酸鈉、亞硝基鐵氰化鈉、次氯酸鈉、硫酸銨（上海生工生物工程有限公司）；胰蛋白酶（1∶250，Sigma有限公司）；85%磷酸、濃鹽酸、濃硫酸、無水乙醇、氯化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸三鈉、氫氧化鈉等（均為分析純）；超純水（實驗室自制）；凡納濱對蝦（購于當?shù)厥袌觯?/p>

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

取大小、體色均一的鮮活對蝦分成質(zhì)量相等的5份（每份約50只），在保證蝦肉熟透的前提下盡量減少對營養(yǎng)成分的破壞，在參考文獻[5]及預試驗的基礎上進行處理：取一份在沸水中處理180 s，取樣后迅速裝入自封袋浸沒于冰水中快速冷卻至室溫，制成水煮樣品；取一份在蒸汽中處理180 s，取樣同上述冷卻后制成汽蒸樣品；取一份在150 ℃的豆油中炸90 s，取樣同上述冷卻后制成油炸樣品；取一份進行微波處理（功率480 W、時間90 s、頻率2 450 MHz）；最后一份不進行處理，作為對照樣品。所有樣品分別測定色值后切片測定水分，去除蝦頭蝦殼速凍后放入冷凍干燥機干燥12 h，分別研磨成粉，于-20 ℃冷藏，備用。

1.3.2 色澤評定

取對蝦樣品，利用JZ-350色彩色差計在其表面中心處測定3次，取平均值，以L、a、b值分別表示明亮度、紅綠度、黃藍度評定其色澤變化，按照式（1）計算色差值ΔE，ΔE值表示干制樣品與對照樣品之間的差值，ΔE值越大表示顏色變化越嚴重[6]。

式中：L和L*，a和a*，b和b*分別為熱處理樣品和對照樣品的明亮度、紅綠度、黃藍度。

1.3.3 蛋白體外消化率的測定

稱取0.5 g樣品粉末，置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水，并用1 mol/L鹽酸將樣品液調(diào)至pH 2.0，加入1 mL胃蛋白酶溶液（酶與底物中蛋白1∶12.5，W/W），置于37 ℃恒溫搖床振蕩模擬體外胃液消化，轉速140 r/min，分別于0，30，90和120 min各取樣2.0 mL，于10 000×g（4 ℃）離心5 min，取上清液，采用考馬斯亮藍染色法（標準曲線方程A=9.003 6C-0.017 5，R2=0.994 9）測定蛋白質(zhì)含量。其余樣液用0.1 mol/L的NaHCO3調(diào)節(jié)至pH 7.0終止模擬胃液消化反應，加入1 mL胰蛋白酶溶液（酶與底物中蛋白1∶62.5，W/W），置于37 ℃恒溫搖床振蕩模擬體外腸液消化，轉速140 r/min，同樣于消化150和240 min各取樣2.0 mL，在85 ℃水浴中處理3 min滅酶，于10 000×g（4 ℃）離心5 min，取上清液，采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)含量（S），根據(jù)凱氏定氮法（標準曲線方程y=0.013 6x+0.000 9，R2=0.991 1）測定的樣品中總蛋白含量（T），按照式（2）計算蛋白質(zhì)的體外消化率[7-8]。

式中：S為上清液中蛋白質(zhì)含量，μg；T為樣品中蛋白質(zhì)總量，μg。

1.3.4 肽段純化

用3 mL甲醇和3 mL體積分數(shù)1%的甲酸溶液活化及平衡HLB柱，取1 mL體外模擬胃腸消化液加入到活化的HLB柱中，用3 mL體積分數(shù)1%的甲酸溶液清洗，用1 mL體積分數(shù)1%的甲酸-乙腈溶液洗脫2次，將洗脫液合并進行氮吹，吹干后加0.5 mL乙腈-水溶液（體積比3∶97，含0.1%甲酸）復溶，渦旋30 s，過PVDF濾膜后用納升級液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3.5 納升級色譜測定及高分辨質(zhì)譜分析條件

將酶切肽段用納升級液相色譜和高分辨質(zhì)譜儀進行分析，肽段以800 bar的壓力直接上樣到PepMap 100 C18分析柱上（250 mm×75 μm，2 μm），用300 nL/min流速進行洗脫，流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B為體積分數(shù)80%乙腈溶液（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序如表1所示，柱溫箱溫度40 ℃。離子源為nano-Flex納噴霧離子源；掃描模式為正離子；毛細管電壓2.0 kV；離子傳輸管溫度320 ℃；RFlens 50%；數(shù)據(jù)依賴型（DDA）采集模式，一級質(zhì)譜分辨率70 000，自動增益目標值（AGC）1×106，最大注入時間（IT）100 ms，掃描范圍（m/z）300～1 500；二級譜圖分辨率設為17 500，最大注入時間80 ms，掃描范圍（m/z）150～2 000，隔離窗口設為1.6 Da，歸一化碎裂能量（NCE）值設為28，碎裂模式為HCD，自動增益值（AGC）為1×105，采集的top N設為20，其余參數(shù)按照默認設置[9]。

表1 納升級液相色譜梯度洗脫分離程序

1.3.6 數(shù)據(jù)庫檢索及統(tǒng)計分析

肽段DDA數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Scientific）軟件的PWF_QE_Basic_Sequest HT模版搜索和CWF_Basic模板組裝，進行搜庫鑒定，檢索UniProt_Penaeus（包含43953條蛋白序列）數(shù)據(jù)庫fasta文件，一級質(zhì)譜中母離子質(zhì)量誤差10×10-6，二級質(zhì)譜中碎片離子質(zhì)量精度0.02 Da，酶為胰蛋白酶（trypsin）和胃蛋白酶（pepsin），完全酶切，漏切數(shù)目為2個，固定修飾為半胱氨酸的烷基化（Carbamidomethyl，+57.021 464 Da），可變修飾為甲硫氨酸的氧化（M，+15.994 92 Da），蛋白N-端乙?；ˋcetyl，+42.010 565 Da）。試驗重復測定3次，結果以平均值±標準偏差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0軟件進行一維方差分析，差異顯著性采用Duncan（鄧肯）檢驗，檢驗水平P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 水分及色澤的變化

由表2可知，汽蒸和水煮處理的對蝦樣品中水分與鮮蝦樣品的無顯著差異（P＞0.05），而油炸和微波處理的對蝦樣品中水分損失較大（P＜0.05），即油炸與微波處理過程中會有較多的水分向外蒸發(fā)損失。L值代表明亮度，a值代表紅綠色，b值代表黃藍色，ΔE表示色差值，ΔE在0～2之間，色差肉眼無法分辨；ΔE在2～3之間，可以稍微清晰的辨別出物質(zhì)間的色差，不過相對來說還不很明顯；ΔE達到3.5～5之間，色澤變化非常明顯；ΔE在5以上，則看起來是2種顏色；汽蒸、油炸、水煮和微波等不同熱處理的對蝦樣品顏色變化較大、且極易辨別。與鮮蝦樣品相比，不同方式熱處理的對蝦樣品顏色變亮、變紅和變黃，這主要是由于鮮蝦中的蝦青素通過酯基與脂肪結合、亞氨基與蛋白質(zhì)和甲殼素結合的顏色呈藍色到綠色，受熱后蛋白質(zhì)部分變性，與蝦青素之間的結合力減弱而分離，顏色變?yōu)榧t色、藍色消失，加之胡蘿卜素等其他色素的變化而導致熱處理后對蝦的紅色指數(shù)與黃色指數(shù)升高。但水煮處理會使對蝦樣品的亮度更大一些，這可能是由于水煮處理過程中蝦殼里的色素等物質(zhì)溶于水從而增加其明亮度，而汽蒸和微波處理會使對蝦變黃和變紅的程度更大一些，主要是由于汽蒸處理過程中蒸汽的能量較大反應更劇烈，促進蛋白質(zhì)變性與蝦青素的分離，加之汽蒸過程中對蝦樣品未與水或油介質(zhì)直接接觸而不會溶解部分水溶性或脂溶性的色素，從而增大對蝦樣品變紅和變黃的程度[10]。微波處理是利用高頻電磁波使得物料內(nèi)部水分子劇烈運動，使其溫度迅速升高而汽化，微波處理比較劇烈、所需時間較短，蛋白質(zhì)變性程度大，因而微波處理的樣品變黃和變紅的程度更大[10]。

表2 不同處理的對蝦樣品中水分與色澤對比

2.2 可溶性蛋白含量及蛋白質(zhì)體外消化率的變化

由表3可知，各種對蝦樣品中蛋白質(zhì)體外消化率均隨著消化時間的增加而增大，消化初始階段油炸和微波處理的樣品中可溶性蛋白含量低于對照樣品中的含量，這主要是熱處理誘導蝦肉蛋白變性而暴露出更多的疏水基團，從而誘導球蛋白結合成無定型或纖維狀的聚集體[11]，加之油炸過程中脂肪氧化的中間產(chǎn)物通過自由基反應或美拉德反應與蛋白質(zhì)進行交聯(lián)，發(fā)生不可逆變性，從而進一步增加可溶性蛋白的損失[12]。不同方式熱處理后蛋白質(zhì)體外消化率顯著增大（P＜0.05），適度的熱處理可以明顯提高蛋白質(zhì)的體外消化率，這主要是由于熱處理在一定程度上可促進蛋白質(zhì)側鏈展開、疏水性部位暴露，蛋白質(zhì)變性暴露出更多的酶解位點而有利于蛋白酶的水解作用，從而提高蛋白質(zhì)的體外消化率。體外模擬腸液消化階段，蛋白質(zhì)的消化率更完全，這與胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶切位點有關，前者屬于廣譜酶主要作用于氨基端或羧基端為芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸的肽鍵[13]，將聚集態(tài)的蛋白質(zhì)水解成松散的形態(tài)。而胰蛋白酶是肽鏈內(nèi)切酶，主要作用于堿性氨基酸精氨酸（R）及賴氨酸（K）羧基所組成的肽鍵[14]，且脯氨酸（P）殘基位于切割位點的羧基側則不發(fā)生切割，可在胃蛋白酶消化的基礎上使蝦蛋白消化得更完全。

表3 不同熱處理對樣品中蛋白質(zhì)體外消化率的影響

2.3 消化產(chǎn)物的鑒定分析

不同的對蝦樣品經(jīng)體外模擬胃液和模擬腸液消化后產(chǎn)物經(jīng)納升級液相色譜分離、四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀測定，其總離子流圖如圖1所示。峰的信號強度達到109且色譜峰分布均勻沒有嚴重的堆疊現(xiàn)象，說明色譜梯度較為合理，質(zhì)譜采集信息良好，方法合適可用于后續(xù)分析。DDA模式采集的數(shù)據(jù)用PD軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索，結果如圖2所示。由鑒定結果可以看出，不同處理的對蝦樣品經(jīng)體外模擬胃腸液消化產(chǎn)物中鑒別出的肽段和蛋白數(shù)量差異顯著（P＜0.05）。同時，隨著消化時間的增加，蝦蛋白被消化得愈加完全，肽段的種類和強度不斷增大，由于胃蛋白酶切割位點具有廣泛特異性，而胰蛋白酶的切割位點主要是在賴氨酸和精氨酸處，胃蛋白酶和胰蛋白酶的切割位點不同導致兩步消化生成的肽段種類差別較大，對蝦樣品經(jīng)胃蛋白酶消化120 min后的產(chǎn)物中共鑒定出歸屬于87個蛋白的538條肽段；在胃蛋白酶消化的基礎上，模擬腸液繼續(xù)消化，胰蛋白酶消化120 min（即總消化時間240 min）的產(chǎn)物中共鑒別出歸屬于387個蛋白的3 205條肽段。5種樣品中都能鑒別出的蛋白共48種，如表4所示：主要是肌球蛋白、肌鈣蛋白、酶類和熱休克蛋白，肌球蛋白在鮮蝦樣品和熱處理的對蝦樣品中均能檢測出，這表明熱處理過程中此蛋白的變化較少或與其含量相對較高易檢出有關，因此該蛋白常被選做用于區(qū)分肉制品中肉蛋白種屬來源的蛋白標志物[15]。而在新鮮蝦樣品中才能鑒別出的蛋白有5種，主要是肌動蛋白，該蛋白常與肌球蛋白的橫突結合成復合物，在高鹽溶液中易分解成肌球蛋白和肌動蛋白，熱處理過程對肌動蛋白的影響較大而不易檢出，可能與其含量及其質(zhì)譜信號強度有關。微波、水煮、汽蒸處理的蝦中鑒別到的肽段和蛋白數(shù)量顯著增加（P＜0.05），可鑒別出的特有蛋白22種，這主要是由于熱誘導蛋白適度變性，蛋白質(zhì)結構部分展開，構象改變，暴露出更多的水解位點，有利于蛋白酶的水解作用，這與熱處理后蛋白的消化率增加、質(zhì)譜鑒別的肽段信號增強、蛋白數(shù)增大的結果一致[16-17]。

圖1 對蝦樣品酶解產(chǎn)物測定的色譜-質(zhì)譜圖

圖2 不同樣品模擬胃腸液消化產(chǎn)物中鑒定的蛋白與肽段數(shù)

接表4

3 結論

不同方式的熱處理不僅顯著影響對蝦中的水分與色澤，熱處理后的對蝦樣品色澤加深，而且熱處理后對蝦樣品中可溶性蛋白含量降低，微波干制樣品中可溶性蛋白含量下降程度更大，這與色澤變化的結果相同。熱處理在一定程度上可提高對蝦中蛋白質(zhì)的體外消化率，且微波、汽蒸和水煮3種方式處理的對蝦中蛋白質(zhì)體外消化率增加得更明顯，這與蛋白質(zhì)的變性及構象改變等有關。高分辨質(zhì)譜鑒別分析表明，體外模擬胃腸消化產(chǎn)物中鑒別出大量肽段，不同方式熱處理的對蝦樣品消化產(chǎn)物中鑒別出的肽段與蛋白數(shù)差異較大（P＜0.05），微波、汽蒸、水煮處理組的肽段和蛋白數(shù)高于鮮蝦對照組，3種方式熱處理后可鑒別出的特有蛋白22種，這可能與熱誘導蛋白適度變性，有利于蛋白酶的水解作用有關。