響應(yīng)面法優(yōu)化提取百香果皮花色苷類色素及其穩(wěn)定性研究

王鑫蒙，艾春辛，趙文靜，石彬，張偉*，郭嬌*

1.新鄉(xiāng)學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）；2.新鄉(xiāng)市博源科技有限公司（新鄉(xiāng) 453003）

百香果果皮中含有花色苷類成分[1]，花色苷類色素在自然界中分布較為廣泛，是沒有毒性且資源較為豐富的天然色素，它可以保護(hù)心血管、抗氧化、抗腫瘤，且具有清除自由基、調(diào)節(jié)免疫功能等生理功能[2-3]。

國內(nèi)外研究報(bào)道花色苷類物質(zhì)的提取方法有超臨界流體萃取法[4]、超聲波輔助提取法[5]、酶法[6]、高壓脈沖電場[7]、微波萃取法[8]。這些方法較為復(fù)雜、對設(shè)備要求較高，而溶劑萃取法[9]比較溫和，對花色苷類色素的破壞性小。溶劑萃取法對百香果皮中的花色苷類色素提取的相關(guān)研究尚未見諸報(bào)道，試驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化溶劑萃取提取花色苷類色素的條件并對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

紫皮百香果（廣西壯族自治區(qū)，網(wǎng)購）；無水乙醇、過氧化氫、亞硫酸鈉、鹽酸、蔗糖（均為分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；定性濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

UV-1600紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子天平（梅特勒托利多）；標(biāo)準(zhǔn)篩（紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠）；DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（廣州番禺旭東阪田電子有限公司）；pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷類色素的提取

將購買的紫皮百香果洗凈去除內(nèi)表皮后放烘箱內(nèi)，溫度40 ℃烘干12 h取出打碎過0.25 mm標(biāo)準(zhǔn)篩備用；準(zhǔn)確稱取1.00 g原料于比色管中，以鹽酸酸化的60%乙醇為提取劑，在溫度50 ℃、料液比1∶30（g/mL）的條件下水浴浸提2 h后用抽濾裝置進(jìn)行處理；取1 mL濾液用緩沖液定容到10 mL，靜置2 h后，在510 nm處測定花色苷類溶液的吸光度，并將其結(jié)果帶入式（1）[10]計(jì)算溶液花色苷含量（mg/L），通過式（2）[10]計(jì)算花色苷提取率（mg/g）[11-12]。

式中：A為510 nm處吸光度；MW為花色苷相對分子質(zhì)量，465；DF為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)，35 481；l為比色皿光程（1 cm）。

式中：c為溶液中花色苷質(zhì)量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；m為原料質(zhì)量，g。

1.3.2 花色苷類色素穩(wěn)定性的分析

將單因素試驗(yàn)獲得的濾液用來做穩(wěn)定性分析。

1.3.2.1 光照穩(wěn)定性分析

分別取適量的濾液于透明和棕色容量瓶中，透明容量瓶放置光照處，棕色容量瓶放置暗處，連續(xù)7 d取1 mL 2種光照條件下的濾液，用緩沖液定容到10 mL，靜置2 h測吸光度。

1.3.2.2 蔗糖濃度穩(wěn)定性分析

分別稱取0，0.1，0.2，1.0，1.5，2.0和2.5 g的蔗糖于10 mL的蒸餾水中配制成不同濃度的蔗糖溶液定容濾液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

1.3.2.3 氧化劑穩(wěn)定性分析

用蒸餾水將H2O2配制成1%，2%，3%，6%和15%的溶液定容濾液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

1.3.2.4 還原劑穩(wěn)定性分析

用蒸餾水將Na2SO3配制成10，20，30，40和60 g/L的溶液定容酸性花色苷類溶液，空白樣用蒸餾水定容，靜置2 h測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)花色苷類色素提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 提取時(shí)間對花色苷類色素提取效果的影響

如圖1所示：花色苷類色素提取率在提取時(shí)間1 h處達(dá)到最大，超過1 h之后提取率逐漸下降；同時(shí)提取時(shí)間加長，花色苷類色素會(huì)受熱分解，使生產(chǎn)周期變長，能耗增加，生產(chǎn)成本變高，所以最佳提取時(shí)間為1 h。

2.1.2 提取溫度對花色苷類色素提取效果的影響

如圖2所示：溫度升高時(shí)，提取液含有的花色苷類色素含量先升高后降低；溫度上升到30 ℃，花色苷類色素的提取率最高；溫度繼續(xù)升高時(shí)，花色苷類色素的提取率下降。這可能與花色苷類色素受熱分解有關(guān)，因此最佳提取溫度為30 ℃。

圖2 不同提取溫度下花色苷類色素的提取率

2.1.3 pH對花色苷類色素提取效果的影響

如圖3所示，pH提高時(shí)，花色苷類色素的提取率在pH 3時(shí)達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)降低趨勢，又因?yàn)榛ㄉ疹惿卦谥行院腿鯄A條件下不穩(wěn)定[11]，所以最佳pH為3。

圖3 不同pH下花色苷類色素的提取率

2.1.4 料液比對花色苷類色素提取效果的影響

如圖4所示，料液比逐漸減小時(shí)，花色苷溶液的吸光度也變得越小，選擇料液比1∶20（g/mL）最佳。

圖4 不同料液比下花色苷類色素的提取率

2.1.5 原料粉碎粒度對花色苷類色素提取效果的影響如圖5所示：粒度從0.18 mm到0.83 mm的過程中，花色苷類色素含量的提取率緩慢下降；由于每2點(diǎn)間的斜率在逐漸減緩，且0.18 mm對設(shè)備要求偏高，也會(huì)增大物料、能源的消耗。所以選擇過篩的物料粒度0.25 mm最佳。

圖5 不同粒度下花色苷類色素的提取率

2.1.6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對花色苷類色素提取效果的影響

如圖6所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對溶液中花色苷類色素含量的影響曲線高低起伏，60%時(shí)花色苷類色素提取率達(dá)到最大。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%最佳。

圖6 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下花色苷類色素的提取率

2.2 花色苷類色素提取工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以花色苷類色素的提取率（Y）為響應(yīng)值，以花色苷類色素提取率有顯著影響的提取時(shí)間（X1）、提取溫度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）和提取液pH（X4）為考察因素，對提取花色苷類色素的最佳工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，Box-Behnken試驗(yàn)因素[13]與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2。對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表1 花色苷類色素提取工藝條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

表2 花色苷類色素提取工藝條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

如表3所示，模型概率值P＜0.000 1顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05不顯著，說明所建立的模型極顯著，可以較好地?cái)M合花色苷類色素的提取條件。通過方差分析，由P值可知各因素影響強(qiáng)弱次序：提取時(shí)間＞提取溫度＞提取劑pH＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。提取時(shí)間、提取溫度對結(jié)果有極顯著影響（P＜0.01），提取劑pH有顯著影響（P＜0.05）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2.2 百香果外果皮花色苷類色素響應(yīng)面分析

四因素交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應(yīng)面曲線及等高線見圖7～圖9。

圖7 時(shí)間與溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線

圖8 pH與乙醇體積分?jǐn)?shù)、時(shí)間交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線

圖9 溫度與pH、乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對花色苷類色素提取率影響的響應(yīng)面和等高線

結(jié)果表明：固定提取時(shí)間，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取劑pH增大時(shí)，溶液中花色苷類色素含量呈現(xiàn)先增加后降低趨勢；提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)兩因素交互影響的等高線未閉合但是響應(yīng)面呈凸形，說明二項(xiàng)式提取時(shí)間影響大；提取時(shí)間、提取劑pH兩因素交互影響的等高線未閉合但是響應(yīng)面呈凸形，說明二項(xiàng)式提取劑pH影響大；分析結(jié)果和表3中的顯著性一致。

利用Design-Expert 11軟件對所得的回歸方程進(jìn)行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)時(shí)間1.555 h、提取溫度55.281 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65.186%、提取劑pH 2.424，此時(shí)花色苷類色素提取率預(yù)測值為3.508 mg/g。為了方便實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)修改為提取時(shí)間1.5 h、提取溫度55 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取劑pH 2.4，在此最優(yōu)條件下，花色苷類色素的提取率為3.520 mg/g，與模型預(yù)測值3.508 mg/g較一致，驗(yàn)證模型的可靠性。

2.3 花色苷類色素的穩(wěn)定性分析

2.3.1 光照對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

如圖10所示，60%乙醇提取出來的花色苷類溶液在避光條件下吸光度高于光照條件下的溶液吸光度。吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩(wěn)定。因此，避光條件有利于色素的保存。

圖10 光照對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

2.3.2 蔗糖濃度對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

如圖11所示，整體對比空白樣可知，在同一波長下，蔗糖濃度越高，溶液吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩(wěn)定。因此，蔗糖濃度對花色苷類色素的穩(wěn)定性有影響，蔗糖濃度越高，對花色苷類色素保護(hù)作用越強(qiáng)。

圖11 蔗糖濃度對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

2.3.3 氧化劑對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

如圖12所示，在同一波長下，氧化劑濃度越大，花色苷類溶液的吸光度越低，說明色素殘存越少，色素越不穩(wěn)定。因此，氧化劑對花色苷類色素的穩(wěn)定性有顯著影響，花色苷類色素抗氧化性能較差。

圖12 氧化劑對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

2.3.4 還原劑對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

如圖13所示，整體對比空白樣可知，在同一波長下還原劑濃度越高，花色苷類溶液的吸光度越高，說明色素殘存越多，色素越穩(wěn)定。因此，還原劑對Na2SO3具有一定的保護(hù)作用，花色苷類色素的耐還原性較好。

圖13 還原劑對花色苷類色素穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

以百香果為原料，以花色苷類色素提取率為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法確定花色苷類色素提取的最佳工藝參數(shù)：百香果皮干燥的粒度0.25 mm過篩、提取時(shí)間1.5 h、提取溫度55 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、pH 2.4、液料比1∶20（g/mL）。在此最優(yōu)條件下，花色苷類色素的提取率為3.520 mg/g，與模型預(yù)測值較一致。

同時(shí)，試驗(yàn)對花色苷類色素的穩(wěn)定性進(jìn)行研究分析，結(jié)果表明避光、蔗糖濃度越高、氧化劑濃度越小、還原劑濃度越大，越有利于花色苷類色素穩(wěn)定。試驗(yàn)結(jié)果為花色苷類色素的實(shí)際生產(chǎn)和儲(chǔ)存條件提供理論依據(jù)。