膠體磨復(fù)合酶法浸提香菇多糖的工藝優(yōu)化

唐坤，龍歡，尚校蘭

1.廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（廊坊 065000）；2.河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心（廊坊 065000）；3.廊坊市食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廊坊 065000）

香菇（Lentinus edodes）是世界上產(chǎn)量第二大的食用菌[1]，我國(guó)也是當(dāng)今世界上最大的香菇生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)[2]。香菇多糖（lentinan，LNT）主要由香菇中的β-1, 3-葡聚糖和其他多糖類物質(zhì)D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖等共同組成[3]，具有免疫調(diào)節(jié)[4-5]、降血脂[6]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[7]、抗氧化[8]和降糖[9]等多種藥理活性，因此在食品、保健品和藥品方向均有廣泛應(yīng)用[10]。

LNT的提取方法有多種，可分為化學(xué)提取法（水、酸或堿為溶劑）、物理提取法（微波或超聲法）和生物提取法（酶解或發(fā)酵）[11-12]，而2種或2種以上提取方法聯(lián)合應(yīng)用的復(fù)合法不僅比單一提取方法節(jié)約時(shí)間，還能提高產(chǎn)率，效果也優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法[3]，因此以水為基礎(chǔ)溶劑，運(yùn)用膠體磨的超微濕粉碎原理[13]，采用膠體磨與復(fù)合酶法聯(lián)用的方法浸提香菇多糖，經(jīng)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化后工藝所得LNT提取率顯著高于同法單一的提取方法（水煎法、超聲波浸提法、膠體磨浸提法）。該法節(jié)能環(huán)保，提取條件溫和，提取效能高，且利用該法提取LNT的研究尚未見(jiàn)諸報(bào)道，因此可為L(zhǎng)NT浸取技術(shù)的優(yōu)化提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干香菇（河北昊藝食用菌股份有限公司）；纖維素酶、果膠酶（河南萬(wàn)邦化工科技有限公司）；幾丁質(zhì)酶（常茂生物化學(xué)工程股份有限公司）。材料均為食品級(jí)。

D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)110833-201908，含量標(biāo)示99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸（試劑均為分析純）；5%苯酚溶液（自配）。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP-電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；722型分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；榮華HH-4數(shù)字恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；JA21002電子分析天平（北京京東世紀(jì)信息技術(shù)有限公司）；酸度計(jì)（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；DHSI6-A多功能紅外水分測(cè)定儀（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；膠體磨（無(wú)錫輕大食品裝備有限公司）；ZXRD-A7140恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海圣科儀器有限公司）；BJ-800A多功能粉碎機(jī)（德清拜杰電器有限公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；金怡牌TDZ4-WS電動(dòng)離心機(jī)（金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 香菇多糖的提取與工藝流程

取凈制后的干香菇，低溫烘烤至含水量6%以下，粉碎，過(guò)0.180 mm孔徑（80目）篩。取5.00 g香菇細(xì)粉，在膠體磨中加一定比例水進(jìn)行充分研磨，所得漿液調(diào)至pH 5.4后加入一定量的復(fù)合酶（W纖維素酶∶W果膠酶∶W幾丁質(zhì)酶=1∶1∶1），在指定溫度下酶解數(shù)分鐘后取出，酶解液置于90 ℃水浴中10 min滅酶，在80℃恒溫水浴攪拌浸提2次，每次1.0 h，過(guò)濾，合并2次濾液，濾液濃縮至15 mL，加3倍乙醇醇沉，在4 ℃靜置24 h，按4 000 r/min離心15 min棄上清液，不溶物干燥，稱重即得。工藝流程：取凈香菇→干燥→粉碎→過(guò)篩→得香菇細(xì)粉→加水研磨（A）→得香菇漿液→調(diào)pH→復(fù)合酶解（B、C、D）→得香菇酶解液→熱提→過(guò)濾→濃縮→醇沉→離心→得香菇粗多糖。

其中，影響多糖提取率的4個(gè)主要因素分別為料液比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）。

1.3.2 香菇多糖的提取率計(jì)算[14]

1.3.2.1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

從已配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）中分別精密吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL于具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，向每個(gè)管中依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL H2SO4，放置10 min，在沸水浴中反應(yīng)2 min，冷卻，在波長(zhǎng)490 nm處，以空白溶液為參比，測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。再以葡聚糖質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 樣品的含量測(cè)定

將干燥后所得香菇多糖加15 mL水稀釋，從中取1 mL，加水稀釋至1 000 mL，從中取2 mL，向管中依次加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5.0 mL H2SO4，放置10 min，在沸水浴中反應(yīng)2 min，冷卻，在波長(zhǎng)490 nm處，以空白溶液為參比，測(cè)樣品的吸光度。試驗(yàn)均3次平行測(cè)定。

1.3.2.3 香菇多糖提取率的計(jì)算[15]

香菇多糖提取率按式（1）計(jì)算。

式中：W為香菇多糖提取率，%；Cs為被測(cè)樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度，μg/mL；D為樣品溶液的稀釋倍數(shù)；V為被測(cè)樣品溶液體積，mL；m為香菇取樣量，g；0.9為葡萄糖換算成葡聚糖的校正系數(shù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

提取中料液比（A）、復(fù)合酶添加量（B）、酶解時(shí)間（C）和酶解溫度（D）是影響香菇多糖提取率的主要因素，因此將依據(jù)1.3.1的步驟進(jìn)行多糖提取的單因素試驗(yàn)。

1.3.3.1 料液比

稱取5.00 g干燥后的香菇細(xì)粉，在復(fù)合酶添加量3%、酶解時(shí)間50 min、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對(duì)香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.2 復(fù)合酶添加量

稱取5.00 g干燥后的香菇細(xì)粉，在料液比1∶40（g/mL）、酶解時(shí)間50 min、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同復(fù)合酶添加量（1.0%，2.0%，2.5%，3.0%和3.5%）對(duì)香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.3 酶解時(shí)間

稱取5.00 g干燥后的香菇細(xì)粉，在料液比1∶40（g/mL）、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解溫度60 ℃條件下，考察不同酶解時(shí)間（30，40，50，60和70 min）對(duì)香菇多糖提取率的影響。

1.3.3.4 酶解溫度

稱取5.00 g干燥后的香菇細(xì)粉，在料液比1∶40（g/mL）、復(fù)合酶添加量2.5%、酶解時(shí)間30 min條件下，考察不同酶解溫度（30，40，50，60和70 ℃）對(duì)香菇多糖提取率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果，從料液比、復(fù)合酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度4個(gè)因素中，確定較適宜的3個(gè)水平，采用L9(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)，以香菇多糖提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化香菇提取工藝，確定最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.5 提取方法的比較

稱取5.0 g香菇，將優(yōu)化后的膠體磨復(fù)合酶法工藝與傳統(tǒng)水煎法、粉碎水煎法、超聲波浸提法、膠體磨浸提法5種提取技術(shù)進(jìn)行比較，觀察不同提取方法對(duì)香菇多糖提取率的影響，不同提取方法見(jiàn)表2，過(guò)濾，合并2次濾液，濾液濃縮至15 mL，加3倍乙醇醇沉，在4 ℃靜置24 h，按4 000 r/min離心15 min棄上清液，不溶物干燥，稱重即得。香菇多糖提取率的計(jì)算方法同 “1.3.2.2”項(xiàng)下“樣品的含量測(cè)定”所述。

表2 香菇不同提取方法的比較

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)用SPSS 20軟件進(jìn)行方差分析，Dunnett法進(jìn)行多組與對(duì)照的定量比較，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可見(jiàn)，葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=0.036X+0.006 9，r=0.999 7，表明葡萄糖質(zhì)量濃度在2.857～14.286 μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響

由圖2可知：料液比在1∶15～1∶40（g/mL）時(shí)，香菇多糖提取率隨香菇濃度的減少反而增大，到1∶40（g/mL）時(shí)多糖提取率最高。但料液比在1∶50（g/mL）時(shí)，多糖提取率反而略有減少。該結(jié)果顯示隨著提取香菇的加水量增加，香菇溶質(zhì)向外的擴(kuò)散速度不斷擴(kuò)大，因此提取率增大[16]。但當(dāng)擴(kuò)散速率達(dá)平衡時(shí)，原料與酶催化反應(yīng)的速率也會(huì)逐漸減弱，進(jìn)而溶質(zhì)擴(kuò)散速率降低，多糖提取率逐漸減少。因此，單因素條件下料液比以1∶30～1∶50（g/mL）為宜，1∶40（g/mL）時(shí)提取效果最好。

圖2 料液比對(duì)香菇多糖提取率的影響

2.3 酶添加量對(duì)香菇多糖提取率的影響

由圖3可知：復(fù)合酶添加量在1%～2.5%時(shí)，香菇多糖提取率隨酶量增加而增大，復(fù)合酶添加量2.5%時(shí)多糖提取率最高，隨著酶量繼續(xù)加大，提取率反而呈下降趨勢(shì)。因此，單因素條件下酶添加量以2.0%～3.0%為宜，但2.5%時(shí)提取效果最好。

圖3 酶添加量對(duì)香菇多糖提取率的影響

2.4 酶解時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響

香菇提取時(shí)酶解時(shí)間考察范圍在30～70 min之間。由圖4可知：在30～60 min范圍內(nèi)其多糖提取率均高于11%，酶解時(shí)間超過(guò)60 min后，提取率反而急速下降，因此，單因素條件下酶解時(shí)間以30～50 min為宜，但30 min時(shí)提取效果最好。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)香菇多糖提取率的影響

2.5 酶解溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響

香菇提取時(shí)酶解溫度考察范圍在30～70 ℃之間。由圖5可知：在30～60 ℃范圍內(nèi)，酶解效率均大于20%，但酶解溫度超過(guò)60 ℃，其多糖提取率隨溫度增高反而急劇下降，因此單因素條件下酶解溫度在30～50 ℃為宜，40 ℃時(shí)提取效果最好。

圖5 酶解溫度對(duì)香菇多糖提取率的影響

2.6 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。影響香菇多糖提取率的因素為料液比＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時(shí)間。最佳工藝組合為A2B2C3D2，即料液比1∶40（g/mL）、酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間40 min。對(duì)該組合進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證，其中香菇提取量擴(kuò)大為原試驗(yàn)量的10倍，平行試驗(yàn)3次，多糖提取率平均值為21.59%，SRSD為1.41%，結(jié)果顯示該法重現(xiàn)性好，工藝條件穩(wěn)定。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.7 提取方法的對(duì)比性驗(yàn)證結(jié)果

如圖6所示，比較不同提取方法對(duì)香菇多糖提取率的影響，膠體磨復(fù)合酶法浸提香菇多糖提取率為21.24%，提取效果依次為膠體磨復(fù)合酶法＞膠體磨浸提法＞超聲波浸提法＞粉碎水煎法＞傳統(tǒng)水煎法。結(jié)果經(jīng)SPSS 20軟件Dunnett雙側(cè)檢驗(yàn)（A組為對(duì)照）的方差分析，膠體磨復(fù)合酶法的提取效率是傳統(tǒng)水煎法的3.3倍（P＜0.05）、粉碎水煎法的1.9倍（P＜0.05）、超聲波浸提法的1.5倍（P＜0.05）、膠體磨浸提法的1.3倍（P＜0.05），顯示膠體磨復(fù)合酶提取方法對(duì)香菇多糖的提取效率與其他提取方法相比具有非常顯著性差異（圖6）。

圖6 不同提取方法對(duì)香菇多糖提取率的影響

3 結(jié)論與展望

膠體磨復(fù)合酶法經(jīng)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、驗(yàn)證試驗(yàn)及與各種常見(jiàn)提取方法的比較，結(jié)果得出膠體磨復(fù)合酶法提取香菇多糖的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶40（g/mL）、酶添加量2.5%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間40 min。該條件下所得到的香菇多糖提取率顯著高于水提法、超聲法和膠體磨法。

LNT的溶劑提取法中，熱水提取法存在長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱、煎煮耗能高、提取雜質(zhì)多、提取效率低的問(wèn)題；酸堿提取法又極易破壞多糖的糖苷鍵和生物活性；超聲波提取法利用超生波的空化效應(yīng)[14]、微波提取法利用微波的熱效應(yīng)盡管均能提高LNT的提取效率[3,17]，但二者由于缺乏配套的生產(chǎn)設(shè)備而不易轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)實(shí)踐中。因此以水作溶媒，利用膠體磨的超微濕粉碎原理，通過(guò)強(qiáng)烈的剪切、摩擦、沖擊、研磨等作用力，破壞香菇細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，將香菇粉研磨成顆粒非常細(xì)微的穩(wěn)定懸浮液[13,18]；加入生物復(fù)合酶（W纖維素酶∶W果膠酶∶W幾丁質(zhì)酶=1∶1∶1）水解纖維素和糖蛋白，促進(jìn)胞內(nèi)溶質(zhì)成分克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的阻力加速溶出擴(kuò)散[19]，以此提高熱水浸提法提取香菇粗多糖的效率，因此該法聯(lián)合運(yùn)用3種提取方法復(fù)合提取香菇多糖，優(yōu)化后的工藝與其他提取方法相比較，提取效率提高1.3～3.3倍（P＜0.05），因此該方法為香菇多糖的產(chǎn)業(yè)化提取工藝的深化提供參考。

我國(guó)是香菇生產(chǎn)大國(guó)，LNT具有豐富的生物活性和多種應(yīng)用方向[20-21]，且提取制備工藝對(duì)LNT化學(xué)結(jié)構(gòu)影響較大，因此安全性強(qiáng)、浸提效率高，且能有效節(jié)能減排的LNT提取制備技術(shù)才最具有生命力和延展性，也是未來(lái)采用新技術(shù)、新工藝提取LNT的研究方向。