保加利亞乳桿菌凍干復(fù)合保護(hù)劑的制備及研究

周莉，譚靜，平洋，羅蓓蓓，王法云*

河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司（鄭州 450002）

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）又稱德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.Bulgaricus），歸屬于乳桿菌屬，是典型的來自乳的乳酸菌[1]。菌體粗而長，兼性厭氧，菌體形態(tài)有長桿型和短桿型。保加利亞乳桿菌對環(huán)境溫度較為敏感，在保藏及運輸過程中，可能會造成菌體失活，最終導(dǎo)致產(chǎn)品中保加利亞乳桿菌存活率下降的情況。然而，益生菌想要發(fā)揮其益生功效，必須保證益生菌在產(chǎn)品和宿主中都保持活性和代謝穩(wěn)定，當(dāng)液態(tài)食品中活菌數(shù)達(dá)到一定數(shù)量[食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010[2]對乳酸菌數(shù)進(jìn)行限量，具體為106CFU/g（mL）]，益生菌才能發(fā)揮益生作用。因此，保護(hù)保加利亞乳桿菌在保藏及運輸過程中的菌體活性尤為重要。

在保存保加利亞乳桿菌過程中，為了避免菌體的衰老死亡，通常是將菌體的水分去除，以避免菌體的新陳代謝，從而保存菌體[3-4]。目前，保加利亞乳桿菌菌粉主要通過真空冷凍干燥技術(shù)來實現(xiàn)，然而冷凍和干燥過程中會使部分細(xì)胞損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化。如果菌體直接進(jìn)行冷凍干燥，存活率很低，但若將菌體懸浮于適宜的介質(zhì)中再進(jìn)行冷凍干燥，菌體的存活率可達(dá)到70%以上[5]。因此，選擇合適的凍干保護(hù)劑非常必要。保護(hù)劑可以改變生物樣品冷凍干燥時的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止冷凍干燥或復(fù)水對細(xì)胞的損害，盡可能保持原有的各種生理生化特性和生物活性[6]，還能保護(hù)乳酸菌抵抗不良環(huán)境，有效促進(jìn)有益菌的生長，進(jìn)一步提高凍干粉中益生菌的存活率。因此，凍干保護(hù)劑不僅影響乳酸菌在凍干過程中的細(xì)胞存活率，還影響保藏期間的細(xì)胞穩(wěn)定性[7]?，F(xiàn)有的冷凍干燥保護(hù)劑對于保加利亞乳桿菌的活性有一定的保護(hù)作用，但是在冷凍干燥工藝中活細(xì)胞損失較大，并不能很好地保持原有的各種生理生化特性和生物活性[8]。因此，開發(fā)一種合適的保加利亞乳桿菌凍干保護(hù)劑顯得尤為重要。

研究以保加利亞乳桿菌為研究對象，分析不同凍干保護(hù)劑對凍干菌體貯藏期間活菌數(shù)的影響，比較不同保護(hù)劑對凍干菌粉的保護(hù)效果，并結(jié)合保存時間分析凍干復(fù)合保護(hù)劑對菌體凍干后存活率的影響；為進(jìn)一步開發(fā)乳酸菌功能性保護(hù)劑，以及提高直投式乳酸菌發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性，提供理論與試驗依據(jù)。

1 試驗與方法

1.1 材料與儀器

菌株：保加利亞乳桿菌（菌種編號：C I C C 20361），中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，實驗室傳代保存。

MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯（Oxoid試劑公司）；氯化鈣、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

儀器：SMX-100手持均質(zhì)儀（三先科技有限公司）；HWHS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（常州金壇良友儀器有限公司）；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；TGL-16冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）；-80 ℃冰箱（海爾集團(tuán)）；milli-Q超純水儀（密理博公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 離心轉(zhuǎn)速和離心時間對保加利亞乳桿菌的影響

無菌條件下取2 mL保加利亞乳桿菌菌液，在20 ℃的溫度條件下離心5 min或10 min，離心轉(zhuǎn)速分別設(shè)為4 000，5 000，6 000，7 000和8 000 r/min；離心結(jié)束后，去除上清液初步脫水，收集菌體，得到保加利亞乳桿菌菌泥。計算得到保加利亞乳桿菌的離心損失率、離心存活率和離心收得率，具體離心工藝參數(shù)見表1。具體計算公式見式（1）～（3）。

表1 離心轉(zhuǎn)速和離心時間對保加利亞乳桿菌的影響

1.2.2 凍干用復(fù)合保護(hù)劑的制備

將半胱氨酸鹽酸鹽、牛血清蛋白溶解于部分無菌水中，用0.22 μm PES無菌濾膜過濾除菌后，得到溶液A；將阿拉伯膠、水蘇糖和菊粉溶解于剩余的水中，115 ℃滅菌20 min，得到溶液B；將溶液A和溶液B混合均勻后，得到保加利亞乳桿菌凍干用復(fù)合保護(hù)劑，存于4 ℃?zhèn)溆?。其中，阿拉伯膠、水蘇糖、半胱氨酸鹽酸鹽、菊粉和牛血清蛋白的用量見表2。

1.2.3 保加利亞乳桿菌凍干菌粉的制備

菌株活化培養(yǎng)后，菌液溫度控制在20 ℃下進(jìn)行離心，離心轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，離心時間為5 min；離心結(jié)束后，去除上清液，收集菌體，得到保加利亞乳桿菌菌泥。

將凍干保護(hù)劑與菌泥按質(zhì)量比3∶1混合均勻，先控制降溫速率10～15 ℃/min降溫至-60 ℃，保溫，冷凍2～3 h，然后放入真空冷凍干燥機中進(jìn)行冷凍干燥，得到保加利亞乳桿菌凍干菌粉。冷凍干燥過程在真空冷凍干燥機中進(jìn)行，整個冷凍干燥過程真空度維持在20～40 kPa，具體過程為：在3 h內(nèi)升溫至-20 ℃，冷凍干燥10 h；再于3 h內(nèi)升溫至30 ℃，冷凍干燥10 h。

1.2.4 不同配比的凍干用復(fù)合保護(hù)劑的凍干效果對比

參照如下步驟，設(shè)置空白例和試驗例，比較不添加凍干保護(hù)劑、添加不同的凍干保護(hù)劑對保加利亞乳桿菌凍干效果的影響。制備的保加利亞乳桿菌凍干菌粉在剛凍干結(jié)束后和常溫保存8周后的活菌數(shù)和平均存活率如表3所示。

1.2.5 凍干復(fù)合保護(hù)劑保存性能測定

將凍干復(fù)合保護(hù)劑，裝入滅菌袋內(nèi)，在不同溫度下分別保存，測定存活率，試驗結(jié)果見表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心轉(zhuǎn)速和離心時間對保加利亞乳桿菌的影響

由表1離心損失率的數(shù)據(jù)可以看出：在6 000 r/min，5 min條件下離心，損失率最高，其次是5 000 r/min，5 min的條件和4 000 r/min，10 min的條件；在8 000 r/min，10 min條件下離心，損失率最低，其次是8 000 r/min，5 min的條件。離心損失率結(jié)果表明，增加離心力和延長離心時間，均可顯著降低損失率。

由表1離心存活率的數(shù)據(jù)可以看出：在6 000 r/min，5 min條件下離心，存活率最高，其次是5 000 r/min，5 min的條件和4 000 r/min，10 min的條件；在8 000 r/min，10 min條件下離心，存活率最低，其次是7 000 r/min，10 min的條件。離心存活率結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速超過7 000 r/min，離心時間超過10 min時，存活率明顯降低。

由表1離心收得率的數(shù)據(jù)可以看出，離心收得率是衡量離心效果的最終體現(xiàn)，它與離心存活率呈正比，而與離心損失率呈反比。因此可在獲得較高離心收得率的前提下，盡量選取較小離心力和較短離心時間進(jìn)行離心。因此優(yōu)選離心轉(zhuǎn)速6 000 r/min，離心時間5 min的離心工藝條件。

2.2 凍干用復(fù)合保護(hù)劑的制備

凍干用復(fù)合保護(hù)劑的制備條件見表2。

表2 制備保加利亞乳桿菌凍干用復(fù)合保護(hù)劑各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù) 單位：%

2.3 不同配比的凍干用復(fù)合保護(hù)劑的凍干效果對比

由表3可知，凍干用復(fù)合保護(hù)劑對冷凍干燥工藝前后保加利亞乳桿菌具有十分顯著的保護(hù)作用。凍干用復(fù)合保護(hù)劑5，在對保加利亞乳桿菌冷凍干燥后，平均存活率能達(dá)到98.5%，比未添加任何保護(hù)劑的保加利亞乳桿菌的平均存活率高出約54.5%。常溫保存8周后，添加凍干用復(fù)合保護(hù)劑的凍干樣品存活率均在80%以上，與未添加任何保護(hù)劑的樣品相比具有極顯著性差異，存活率高出約46.7%，最高可達(dá)60.9%。而且對比不同配比的凍干保護(hù)劑可以看出，制備凍干用復(fù)合保護(hù)劑的各組分的用量比會對保加利亞乳桿菌的凍干效果產(chǎn)生明顯影響，且在相同的質(zhì)量濃度下，復(fù)合凍干保護(hù)劑比單一組分的凍干保護(hù)劑的保護(hù)效果要好很多（剛凍干后平均存活率就能高出51.5%）。其中凍干用復(fù)合保護(hù)劑5的保護(hù)效果最佳，其最佳配比為3%阿拉伯膠、0.75%水蘇糖、2%半胱氨酸鹽酸鹽、8%菊粉、0.8%牛血清蛋白，余量為水。

表3 凍干用復(fù)合保護(hù)劑對保加利亞乳桿菌的保護(hù)作用

2.4 凍干復(fù)合保護(hù)劑保存性能測定

由表4可以看出，在相同的保藏溫度下，在真空保藏后，添加凍干用復(fù)合保護(hù)劑的保加利亞乳桿菌的存活率高于常壓保藏，在真空保藏條件下，-20 ℃的低溫保藏后保加利亞乳桿菌的存活率高于室溫和-4℃條件下保藏[11]。因此確定制備凍干用復(fù)合保護(hù)劑的適宜保藏條件，即真空條件下-20 ℃保藏。

表4 凍干復(fù)合保護(hù)劑保存性能測定

3 結(jié)論與討論

研究制備的凍干用復(fù)合保護(hù)劑采用多種活性組分，不添加任何化學(xué)合成物質(zhì)，安全性高；提高了保加利亞乳桿菌菌體存活率；后期穩(wěn)定好，能在常溫下保持較高的存活率。對保加利亞乳桿菌冷凍干燥后，平均存活率能達(dá)到98.5%，比未添加任何保護(hù)劑的保加利亞乳桿菌的平均存活率高出約54.5%；常溫保存8周后，研究制備的凍干用復(fù)合保護(hù)劑的凍干存活率均在80%以上，與未添加任何保護(hù)劑的樣品相比具有極顯著的差異，存活率高出約46.7%，最高可達(dá)60.9%。

研究制備的凍干用復(fù)合保護(hù)劑在選擇配方時考慮到保加利亞乳桿菌在凍干過程中受到的多重因素的影響，因此選擇了不同機理的凍干保護(hù)劑進(jìn)行加強或協(xié)同作用。凍干保護(hù)劑的存在可以使保加利亞乳桿菌更加有效抵御在冷凍干燥過程中由工藝引起的失活或死亡，從而減少冷凍干燥過程中菌體的死亡率，增加存活率。其中，半胱氨酸鹽酸鹽是優(yōu)良的抗氧化劑，能夠抵抗機體氧自由基的破環(huán)，增強對外界環(huán)境的耐受力，提高菌體穩(wěn)定性，使菌體存放穩(wěn)定、耐加工和保存。水蘇糖能在菌體凍干過程中為其在胞外提供一個較好的物理保護(hù)環(huán)境；且在進(jìn)入人體后，水蘇糖在胃腸道被菌體利用后分解成二糖、三糖等，可以激發(fā)體內(nèi)的免疫活性因子，從而活化免疫細(xì)胞，促進(jìn)機體產(chǎn)生可以抵抗外界疾病的抗體[12]，使機體產(chǎn)生干擾素的能力增強，對增強人體免疫力有極大的促進(jìn)作用；此外，水蘇糖還具有功能活性，能夠直接增殖腸道菌體。菊粉有益于菌體的增長和繁殖，改善腸道環(huán)境，提高抵抗力；血清蛋白具有提升菌體的自我保護(hù)能力，防止其遭到一定的破壞，從而對其活性進(jìn)行保護(hù)。

制備的保加利亞乳桿菌凍干用復(fù)合保護(hù)劑具有生產(chǎn)成本低、適用性高、綠色安全等優(yōu)點，能提高保加利亞乳桿菌的存活率和穩(wěn)定性，從而延長貨架期。研究為益生菌的凍干研究提供了行之有效的方法，可以解決益生菌制劑在生產(chǎn)、使用過程中活性、數(shù)量及效價損失嚴(yán)重的問題[13]，具有較強的研究價值和商業(yè)指導(dǎo)意義，前景廣闊，競爭力強，為現(xiàn)代化社會帶來更好的經(jīng)濟(jì)效益。