石榴皮多酚的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化研究

高善行，張瑞祎，王毓甜，李景明，臧佳辰*

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）

石榴（Punica granatumL.），石榴科石榴屬植物，酸甜可口，具有豐富的氨基酸、維生素、纖維素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前中國(guó)的石榴栽種面積約170萬(wàn)畝（1畝≈666.67 m2），居世界首位，年產(chǎn)量100萬(wàn) t以上[2]。如今品種豐富多樣的鮮食石榴、果汁、果酒、石榴籽油等相關(guān)產(chǎn)品，均展示了石榴及其綜合產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。

但在石榴的加工過(guò)程中，約占石榴質(zhì)量30%的石榴皮[3]，僅僅作為飼料或肥料被簡(jiǎn)單處理，或被直接丟棄，造成了較大的浪費(fèi)[4-5]。通過(guò)對(duì)化學(xué)成分的分析，石榴皮富含多酚、丹寧、鞣質(zhì)、黃酮、有機(jī)酸等重要活性物質(zhì)[6-7]，其中多酚約占石榴皮干重的10%～20%[8]，包括安石榴苷、鞣花酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、綠原酸等多種物質(zhì)[9-10]，開(kāi)發(fā)價(jià)值巨大。

石榴皮多酚的抗氧化活性可超過(guò)大部分植物[11-12]，已得到了大量體內(nèi)與體外試驗(yàn)的驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)自由基的清除，石榴皮多酚能夠有效阻止其對(duì)組織和器官的破壞作用，有助于提高食品的安全性與品質(zhì)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)天然食品添加劑提供了理論依據(jù)和思考。

然而，因多酚類化合物性質(zhì)較不穩(wěn)定，易被氧化破壞，因此提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高都有可能導(dǎo)致石榴皮多酚的損失[13]，不僅增加生產(chǎn)成本，還會(huì)降低石榴皮多酚抗氧化等活性。因此，不斷改進(jìn)石榴皮多酚的生產(chǎn)工藝，提高提取效率勢(shì)在必行。

超聲波提取是一種新興的提取方法，因其提取時(shí)間短、效率高等特點(diǎn)，逐漸被應(yīng)用到植物活性物質(zhì)（如多酚）的提取當(dāng)中，也是一種提取石榴皮多酚的重要途徑[14-15]。已有研究證明，在超聲波提取過(guò)程中，能夠省去加熱的工藝，并且極大節(jié)省了提取時(shí)間[16]。與此同時(shí)，酶的使用可以在前處理過(guò)程中溫和、高效地獲取多酚原料，避免極端條件破壞多酚結(jié)構(gòu)，影響其功能活性。因此，試驗(yàn)將聯(lián)合酶法和超聲法進(jìn)一步優(yōu)化石榴皮多酚提取工藝。

綜上所述，石榴皮多酚的功能活性非常豐富，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景，因此可以進(jìn)一步改進(jìn)石榴皮多酚提取方法，提高石榴皮多酚的提取效率，以推動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的應(yīng)用和發(fā)展。研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以復(fù)合酶解、溶劑提取、超聲波輔助提取的方式，改良現(xiàn)有提取石榴皮多酚的方法。同時(shí)，試驗(yàn)重點(diǎn)測(cè)定了不同提取方案中石榴皮多酚對(duì)于自由基的清除活性，對(duì)主要活性物質(zhì)作定性與定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴皮：由市售石榴獲得，取果皮淡黃色部分，通過(guò)清洗、破碎、干燥等程序，在低溫條件下備用。

1.2 儀器及試劑

HW.W21.600C電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；CF16RN高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；DZF-6213電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Cary-50紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司）；2000D超純水器（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；KQ2200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Venusil MP-C18液相色譜柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）。

纖維素酶、果膠酶（北京Solarbio公司）；無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、沒(méi)食子酸（北京化學(xué)試劑有限公司）；Folin-Ciocalteu試劑（美國(guó)Sigma公司）；DPPH（上海阿拉丁生化科技）；沒(méi)食子酸、安石榴苷、兒茶素、鞣花酸（HPLC≥98%，Solarbio）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)合酶輔助提取

復(fù)合酶提取方法在王華斌等[17]的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化得出。準(zhǔn)確稱取1.00 g石榴皮粉末于50 mL離心管中，按照1∶20 g/mL的料液比，加入20 mL質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的酶溶液，混勻后在40 ℃下水浴保溫40 min，在3 000 r/min下離心10 min，分離上清液備用，在95℃下加熱10 min以滅活酶，沉淀用于下一步提取。

在相同總質(zhì)量濃度下，設(shè)置不同比例的纖維素酶與果膠酶，配制復(fù)合酶溶液。檢測(cè)不同復(fù)合酶條件下，酶解所得石榴皮多酚產(chǎn)率和抗氧化活性，以得到最適宜提取的復(fù)合酶比例。

1.3.2 超聲波-有機(jī)溶劑聯(lián)合提取單因素試驗(yàn)

在1.3.1小節(jié)的沉淀中加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%和70%的乙醇溶液，料液比選取1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL），混勻后，在100 W超聲波，30，40，50，60和70 ℃水浴溫度下提取5，10，15，20和25 min。在3 000 r/min下離心10 min，棄去沉淀，將上清液與1.3.1小節(jié)中的上清液合并后于遮光條件下保存，得到石榴皮多酚提取液。每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值。

1.3.3 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間各3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)以篩選最佳反應(yīng)條件。

1.3.4 石榴皮多酚的總酚含量測(cè)定

試驗(yàn)在周帆等[18]的測(cè)定方法上稍作改進(jìn)，采用Folin-Ciocalteu法測(cè)定。將樣品提取液稀釋10倍，用移液器量取5 μL，加入195 μL蒸餾水，加入200 μL Folin試劑，再加入600 μL 15%的Na2CO3溶液，混勻后，避光反應(yīng)30 min。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白對(duì)照作為樣品溶液的空白對(duì)照，測(cè)定波長(zhǎng)760 nm下樣品溶液的吸光度。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程按式（1）計(jì)算提取液中的酚類含量（mg GAE/g DW）。

式中：GAE為沒(méi)食子酸當(dāng)量，DW為干重。

1.3.5 DPPH自由基清除率的測(cè)定

石榴皮多酚清除DPPH自由基的清除率在鄧娜等[19]方法基礎(chǔ)上改進(jìn)。用無(wú)水乙醇將石榴皮提取液稀釋至原來(lái)濃度的0.01倍，取500 μL稀釋后的樣品溶液，加入500 μL 0.1 mmol/L的DPPH自由基溶液混勻后靜置，避光30 min，波長(zhǎng)516 nm下測(cè)定各溶液的吸光度，記為Ai；以相同體積的無(wú)水乙醇代替DPPH自由基溶液作為空白，記為A0；相同體積無(wú)水乙醇代替樣品溶液作為對(duì)照，記為A1。所有樣品平行測(cè)定3次，取平均值。按式（2）計(jì)算石榴皮多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)的質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行方差分析（S-N-K法）和直觀分析，確定各因素合適的試驗(yàn)水平數(shù)和最佳的提取多酚條件。

1.3.7 HPLC法鑒定

取1.3.4小節(jié)中抗氧化活性最高，最低與中等的樣品，用甲醇稀釋10倍后，過(guò)0.22 μm有機(jī)膜備用。色譜測(cè)定參數(shù)見(jiàn)表1。

在使用前預(yù)先對(duì)流動(dòng)相過(guò)0.45 μm有機(jī)膜，超聲脫氣30 min備用。同時(shí)對(duì)液相色譜設(shè)備及管路進(jìn)行脫氣。使用甲醇沖洗管路，將檢測(cè)器波長(zhǎng)調(diào)節(jié)至280 nm，預(yù)熱30 min。

設(shè)置所需梯度洗脫程序，進(jìn)樣各混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品溶液，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄其對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間及峰面積，以保留時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，由此可繪制得到四種標(biāo)準(zhǔn)品的液相標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，可計(jì)算得出以上四種成分的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶種類對(duì)提取效果的影響

根據(jù)酶反應(yīng)高度專一性的特點(diǎn)，試驗(yàn)使用不同種類酶（纖維素酶、果膠酶、不同比例復(fù)配的纖維素酶-果膠酶復(fù)合酶），水解原料中的細(xì)胞壁組分，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使植物多酚等有效成分更易溶進(jìn)溶劑中，將活性物質(zhì)釋放，達(dá)到提取的目的。在其他因素（溫度、提取時(shí)間等）均相同的條件下，按照1.3.2小節(jié)所示步驟，進(jìn)行復(fù)合酶解輔助提取。在測(cè)定總酚含量與DPPH自由基清除能力后，可得不同酶的種類對(duì)提取效果的影響，如表2所示。

表2 不同復(fù)合酶的酶解效果

通過(guò)不同酶種類對(duì)提取效果的初步試驗(yàn)，選擇W纖維素酶∶W果膠酶=1∶2的復(fù)合酶進(jìn)行后續(xù)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)，在此條件下酶解并提取，可得相對(duì)較高的總酚含量與自由基清除率。

2.2 影響石榴皮多酚提取的條件確定及DPPH抗氧化分析

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)確定

由圖1可知，過(guò)高或過(guò)低的乙醇體積分?jǐn)?shù)下石榴皮多酚的得率與抗氧化能力均較低，可能由于過(guò)高的乙醇體積分?jǐn)?shù)，溶劑與石榴皮多酚的極性差異較大，溶解度下降。而過(guò)低體積分?jǐn)?shù)的乙醇破壞多酚類物質(zhì)與糖類、蛋白質(zhì)氫鍵及疏水鍵能力較弱，從而提取效果不佳。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下總酚含量與自由基清除率

相較而言，40%左右的乙醇體積分?jǐn)?shù)作為溶劑，與石榴皮中酚類物質(zhì)極性相近，因此可以較好地溶出石榴皮多酚等活性成分，多酚含量達(dá)167.58 mg GAE/g DW，此時(shí)自由基清除率可達(dá)28.74%，與先前研究中提取效果較好的結(jié)論相符[20]，亦與前人報(bào)道一致[21]。

綜合各項(xiàng)參數(shù)，選取40%作為標(biāo)準(zhǔn)，30%，40%和50%為較合適的乙醇體積分?jǐn)?shù)試驗(yàn)水平。

2.2.2 料液比確定

從圖2可看出，隨著液體占比不斷增大，總酚含量與自由基清除率也在不斷升高，料液比在1∶10～1∶25（g/mL），總酚含量與自由基清除率呈現(xiàn)較為明顯的上升，且料液比在1∶25（g/mL）附近時(shí)，可取得較高的總酚含量與DPPH自由基清除率。

圖2 不同料液比下總酚含量與自由基清除率

在1∶25～1∶30（g/mL），雖然多酚得率與自由基清除率仍在上升，但此過(guò)程中增長(zhǎng)幅度較為緩慢，可能因多酚已經(jīng)充分溶解所致。綜合實(shí)際生產(chǎn)中成本與節(jié)能因素，選擇料液比1∶25（g/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）為較合適的料液比試驗(yàn)水平。

2.2.3 時(shí)間確定

時(shí)間是影響石榴皮多酚提取效果的重要因素之一。從圖3中得出，兩條曲線均隨時(shí)間的增長(zhǎng)先增加后降低。提取時(shí)間從5 min增長(zhǎng)至20 min時(shí)，多酚從原料中不斷溶出，提取效果較為充分。在此之后，可能由于多酚穩(wěn)定性較低，在浸提過(guò)程中降解，得率與抗氧化能力稍有下降。綜上所述，選擇20 min作為標(biāo)準(zhǔn)，15，20和25 min為較合適的時(shí)間試驗(yàn)水平。

圖3 不同時(shí)間下總酚含量與自由基清除率

2.2.4 溫度確定

在不同溫度下，石榴皮多酚的得率和自由基清除率同樣呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。如圖4所示，在60 ℃左右，為相對(duì)適宜的提取溫度。溫度升高有利于分子運(yùn)動(dòng)，溶解速率加快，有助于活性物質(zhì)的溶出。當(dāng)溫度繼續(xù)升高之后，由于多酚在高溫下不穩(wěn)定，易降解，因此得率與抗氧化活性稍有下降。綜上所述，60 ℃作為標(biāo)準(zhǔn)，50，60和70 ℃為較合適的溫度試驗(yàn)水平。

圖4 不同溫度下總酚含量與自由基清除率

2.3 總酚含量與總抗氧化力間的相關(guān)性

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別計(jì)算在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時(shí)間與溫度下石榴皮多酚的得率與自由基清除率之間的線性相關(guān)系數(shù)（R2），結(jié)果如表3所示。

表3 總酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性

由表3可以看出，在多種不同條件提取的石榴皮多酚中，其總酚含量與抗氧化活性都存在較強(qiáng)的正相關(guān)性，驗(yàn)證了石榴皮多酚的抗氧化特性，并且在一定范圍內(nèi)隨濃度升高而增強(qiáng)。

2.4 提取條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)（表4），對(duì)所得提取液測(cè)定DPPH自由基清除率。通過(guò)極差分析法可知，各因素對(duì)抗氧化活性的影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞時(shí)間＞溫度，并且得出了可能更佳的提取工藝，即A3B3C1D2，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比1∶30（g/mL），時(shí)間15 min，溫度60 ℃。隨后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在其他因素水平一致的情況下進(jìn)行提取，重復(fù)測(cè)定DPPH自由基清除率35.62%，高于正交試驗(yàn)中試驗(yàn)6的抗氧化能力，是獲取高抗氧化性石榴皮多酚較好的提取方法。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)方差分析（表5）表明：整體試驗(yàn)的差異顯著，模型P＜0.001，初步說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果有較強(qiáng)顯著性；各因素A、B、C、D的顯著性均滿足P＜0.05，說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)較為合理，各因素對(duì)石榴皮多酚的自由基清除率均有顯著影響，且影響順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞料液比＞時(shí)間＞溫度，與上文分析得出的結(jié)論一致。

表5 正交試驗(yàn)方差分析表

2.5 石榴皮多酚的HPLC法鑒定

2.5.1 石榴皮多酚中四種主要成分的含量

試驗(yàn)采取外標(biāo)法，保留時(shí)間定性，峰面積定量，作出四種待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，且R2＞0.99，說(shuō)明在該檢測(cè)范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.5.2 石榴皮多酚的高效液相色譜檢測(cè)

四種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與出峰順序如圖5（a）所示。在此條件下進(jìn)行液相色譜，4種待測(cè)成分均得到了較好的分離。其中安石榴苷存在α、β兩種同分異構(gòu)體，因此在液相色譜中存在保留時(shí)間不同的兩個(gè)色譜峰。在此基礎(chǔ)上對(duì)三種抗氧化活性不同的樣品（分別編碼為高、中、低抗氧化性）進(jìn)樣并通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)，結(jié)果如圖5（b）所示。四種成分的分離度較好，保留時(shí)間較穩(wěn)定，且各成分的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，因此可采用上述線性回歸方程對(duì)樣品中四種酚類物質(zhì)的含量進(jìn)行定量分析（表6）。

圖5 樣品液相色譜

表6 石榴皮多酚樣品中4種酚類物質(zhì)測(cè)定單位：μg/mL

在測(cè)定的抗氧化活性不同的三種樣品中，含量順序?yàn)榘彩褴眨诀坊ㄋ幔緵](méi)食子酸＞兒茶素。通過(guò)計(jì)算可得出，石榴皮多酚的抗氧化活性與其中主要活性成分的含量有一定的相似性，特別是作為含量最高且抗氧化能力最強(qiáng)的安石榴苷，通過(guò)試驗(yàn)可驗(yàn)證這一結(jié)論，即其含量或?qū)@著影響石榴皮多酚樣品的抗氧化活性。

3 討論與結(jié)論

以石榴皮多酚為研究對(duì)象，分析其提取過(guò)程、抗氧化能力與組成分析。采用的復(fù)合酶解—超聲—溶劑浸提法，較之傳統(tǒng)的溶劑浸提法而言，更加高效，且對(duì)于石榴皮多酚中主要成分安石榴苷也有較好的提取效果，具有良好的發(fā)展前景。

通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，考察不同水平對(duì)提取石榴皮多酚的影響，得出0.20 mg/mL的復(fù)合酶濃度（W纖維素酶∶W果膠酶=1∶2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶30（g/mL）、時(shí)間15 min、溫度60 ℃為較適宜的提取條件，顯著優(yōu)于其他條件下所提取的抗氧化活性（P＜0.01）。此時(shí)總酚含量達(dá)200.32 mg GAE/g DW，DPPH自由基清除率為35.62%。并且，石榴皮多酚的總酚含量與抗氧化能力在一定范圍內(nèi)呈線性正相關(guān)關(guān)系。

進(jìn)一步探索石榴皮多酚中具抗氧化活性的多酚成分，通過(guò)HPLC高效液相色譜法進(jìn)行分析可以發(fā)現(xiàn)，石榴皮多酚的含量與抗氧化性呈現(xiàn)正相關(guān)性。不同樣品中均存在安石榴苷＞鞣花酸＞沒(méi)食子酸＞兒茶素含量趨勢(shì)，因此可推測(cè)質(zhì)量組成及抗氧化活性的主要成分為安石榴苷。