正交試驗(yàn)優(yōu)化齒瓣石斛多糖提取工藝

劉洪均，包譽(yù)，胡江苗，何桃斌*，楊青松*

1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650504）；2.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院（昆明 650504）；3.中國科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650201）

石斛屬（Dendrobium）是蘭科（Orchidaceae）植物中第一大屬，全球有約1 500種，廣泛分布在亞洲、歐洲、大洋洲等地區(qū)[1]。在我國，已報(bào)道的石斛屬植物超過80種[2]。石斛為名貴中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主治熱病傷津、胃痛干嘔、肺燥干咳等癥[3]。藥理研究表明其具有抗衰老[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、擴(kuò)張血管[7]、降低血糖[8]等多種活性。齒瓣石斛（DendrobiumdevonianumPaxt），又稱紫皮石斛、紫皮蘭、水打棒、黃草等，在我國主要分布于云南、廣西、貴州、西藏南部等地，具有滋陰益胃、生津止渴之功效[9-10]。云南省保山市龍陵縣是齒瓣石斛傳統(tǒng)分布區(qū)，也是齒瓣石斛主要種植區(qū)，初步統(tǒng)計(jì)全縣種植齒瓣石斛3萬余畝（1畝≈666.67 m2），有著“紫皮石斛之鄉(xiāng)”的美譽(yù)?！对颇鲜∈称钒踩胤綐?biāo)準(zhǔn)-紫皮石斛》發(fā)布，并于2018年2月19日正式實(shí)施。自此，齒瓣石斛除了傳統(tǒng)加工楓斗之外，還可以作為地方特色食品。

齒瓣石斛多糖含量高，平均在30%左右[11]，特色食品加工過程中，為滿足不同產(chǎn)品需求，對(duì)多糖得率、黏度、透明度等有不同要求。為探討合理的齒瓣石斛多糖的提取方法，提升齒瓣石斛加工工藝，選取云南產(chǎn)齒瓣石斛為原料，通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，測(cè)定其多糖的提取率，找到較為優(yōu)化的多糖提取工藝，為日后對(duì)齒瓣石斛的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

齒瓣石斛（云南省龍陵縣龍陵石斛研究所）；葡萄糖（XK13-201-00115，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；蒽酮（Solarbio）；硫酸（四川西隴化工有限公司），均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-1冷凍干燥機(jī)（北京亞泰科隆儀器有限公司）；SK-18TC超聲波清洗器（上?？苾x）；DL-6M離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；FST-111-80超純水機(jī)（上海富待特儀器設(shè)備有限公司）；DK-8AD電熱恒溫水浴槽（上海一恒科技有限公司）；-80 ℃超低溫冰箱（中國海爾集團(tuán)）；FDV超微粉碎機(jī)（北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司）；SI-114電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；移液器（大龍儀器）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices Flexstation 3）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理

試驗(yàn)材料所用的齒瓣石斛采自云南龍陵。摘取當(dāng)年生新鮮齒瓣石斛，洗凈后去葉，只留其莖，放入干燥箱中烘干，取干燥的石斛樣品，放入超微粉碎機(jī)中粉碎待用。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別取0.05，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80和1.00 mL的0.1 g/L葡萄糖溶液于標(biāo)記好的小離心管中，用蒸餾水補(bǔ)到1.0 mL，此為標(biāo)準(zhǔn)樣品。分別加入4.00 mL蒽酮試劑，迅速放到冰水浴中冷卻，各管加完后一起放入沸水浴中，在沸水中沸水浴10 min（自水沸起記時(shí)），而后用自來水冷卻。室溫放置10 min左右。另以1.0 mL蒸餾水同上平行操作，用移液槍分別移200 μL到全透明微孔板內(nèi)，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，將加好樣的全透明微孔板放入微孔板檢測(cè)系統(tǒng)中，在波長(zhǎng)620 nm處測(cè)其吸光度。

1.3.3 齒瓣石斛多糖含量的測(cè)定

按線性回歸方程計(jì)算齒瓣石斛多糖含量。

1.3.4 齒瓣石斛多糖提取率的計(jì)算試驗(yàn)是以提取齒瓣石斛多糖的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，齒瓣石斛多糖提取率根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中：ω為多糖提取率，%；a為糖含量，μg/mL；b為凍干試驗(yàn)量，g；c為凍干后質(zhì)量，g；d為石斛粉質(zhì)量，g。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以提取方式、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)5個(gè)因素，根據(jù)不同條件，針對(duì)提取方式設(shè)置2個(gè)水平，料液比和提取溫度設(shè)置4個(gè)水平，提取時(shí)間和提取次數(shù)設(shè)置3個(gè)水平，應(yīng)用正交表生成軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1）。

表1 試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由吸光度（x）與濃度（y）進(jìn)行線性回歸分析，如圖1所示。其回歸方程為y=0.296 4x+0.001 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，即葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，因此可用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖濃度。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 齒瓣石斛多糖含量計(jì)算

用樣品在波長(zhǎng)620 nm處的吸光度帶入公式計(jì)算得出各個(gè)樣品的糖含量，如表2所示。

表2 齒瓣石斛不同樣品吸光度

接表2

2.3 齒瓣石斛多糖提取率分析

由表2可知，編號(hào)為48的樣品多糖含量最高，但是，試驗(yàn)是以提取齒辦石斛多糖的提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而判斷齒瓣石斛多糖提取的最佳提取工藝，所以經(jīng)上述試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)計(jì)算多糖提取率，按式（1）計(jì)算，具體計(jì)算結(jié)果如表3所示。

表3 齒瓣石斛不同樣品多糖提取率

接表3

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)因素水平表進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。料液比、提取方式、提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間均對(duì)樣品提取多糖的含量有顯著影響，影響程度依次為D＞E＞B＞C＞A，即提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞液料比＞提取溫度＞提取方式。通過極差分析得到的理論最優(yōu)組合A2B3C4D1E1，試驗(yàn)驗(yàn)證其多糖提取率（27.197%）不如正交試驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果A1B3C4D2E2（提取率30.664%），即超聲提取、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度100 ℃、時(shí)間4 h、提取次數(shù)2次。由表5方差分析結(jié)果可知，通過在0.05顯著水平上的檢驗(yàn)，提取時(shí)間和提取次數(shù)2種因素對(duì)齒瓣石斛多糖提取得率有顯著影響。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析

以最佳提取條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到齒瓣石斛多糖提取得率30.66%。說明該提取條件具有較好的合理性和可靠性，適用于齒瓣石斛多糖的提取。

3 結(jié)論與討論

由正交試驗(yàn)分析可知：提取方式、料液比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間均對(duì)樣品提取多糖的含量有顯著影響，其因素主次順序?yàn)镈＞E＞B＞C＞A，即最重要的因素為提取時(shí)間，其次是提取次數(shù)，再次是料液比、提取溫度和提取方式。最終得到的齒辦石斛多糖的最佳提取條件為超聲提取、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度100 ℃、時(shí)間4 h、提取次數(shù)2次，提取率為30.66%。在此工藝條件下，所得齒瓣石斛多糖提取率較高，具有省時(shí)、高效、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，可為齒瓣石斛深加工提供新的工藝方案。

根據(jù)結(jié)果得知，提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)齒瓣石斛多糖提取率有顯著的影響。就提取時(shí)間而言，提取的時(shí)間越長(zhǎng)，多糖溶出越多。王洪云等[12]研究也表明提取時(shí)間對(duì)齒瓣石斛多糖提取率影響最大。提取次數(shù)越多，提取效率也越高，因?yàn)槊看翁崛《紝⒏鼡Q新的溶劑，使得多糖溶出量也隨之增加。劉靜平等[13]在鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝中同樣發(fā)現(xiàn)，提取次數(shù)對(duì)多糖的提取有極顯著的影響。秦令祥等[14]采用閃提法提取香菇多糖，結(jié)果表明提取次數(shù)對(duì)香菇多糖的提取率影響較大。石斛提取加工過程中，傳統(tǒng)熱水回流提取方案溶出率較高，但同時(shí)也存在提取時(shí)間長(zhǎng)、成本高、雜質(zhì)多、澄清度差等不足之處[15]。超聲提取法是利用超聲波對(duì)細(xì)胞進(jìn)行空化作用，引起細(xì)胞的強(qiáng)烈振動(dòng)，使有效成分加速溶解到溶劑中，具有綠色、高效的特征，從而更好、更快地對(duì)多糖進(jìn)行提取[16-17]。超聲提取有利于多糖的迅速溶出和擴(kuò)散，比回流提取更加省時(shí)、高效。孟繁磊等[18]對(duì)刺五加多糖的超聲提取工藝進(jìn)行研究，采用超聲法提取刺五加多糖的平均提取率為10.87%。葉余原[19]采用超聲法提取鐵皮石斛多糖，在同樣的條件下，超聲法比水提法更加高效。孟良玉等[20]對(duì)枸杞多糖的超聲提取工藝中，同樣表明超聲提取法可有效提高多糖的得率。因此，該工藝可為齒瓣石斛多糖提取提供一個(gè)新方案，為今后的深入加工利用提供一些參考。