葫蘆籽的超聲波輔助三相分配提取工藝

黃正虹，汪祖華*

1.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心（貴陽 550000）；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（貴陽 550000）

葫蘆是葫蘆科的一種常見草本植物，被廣泛種植于亞洲、歐洲和南美洲。葫蘆籽含有豐富的不飽和脂肪酸和生物活性物質(zhì)的油[1]、蛋白質(zhì)、植物甾醇、維生素和多糖。研究表明，葫蘆籽油具有極好的保健功效；葫蘆籽油提取的蛋白質(zhì)具有抑制細菌生長、抑制炎癥和降低血糖等生理功能；從葫蘆果肉中提取的多糖具有增加血清胰島素水平、降低血糖水平和改善葡萄糖耐量的能力，可用作新型抗胰島素劑[2-4]。

超聲波輔助三相分配提?。║TPP）技術(shù)是一種綠色、高效的提取方法，是將粗提取物或懸浮液與固體鹽和有機溶劑混合，同時形成三種不同的相[4]。上相是叔丁醇層，主要含有脂類、色素等非極性化合物，中間的沉淀相是蛋白質(zhì)層，下面的水相是水層，其中含有一些極性化合物，如多糖。

近年來，雖然UTPP技術(shù)應(yīng)用于從天然作物中提取和純化酶、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖和其他物質(zhì)，但是很少使用UTPP技術(shù)同時提取油、蛋白質(zhì)和多糖的研究。因此，研究的目的是通過UTPP技術(shù)同時提取分離CSO、CSP和CSPS。研究考察了硫酸銨添加量、叔丁醇與漿液的比例、pH、超聲功率、輻射時間和占空比對CSO、CSP和CSPS提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

葫蘆籽于中國內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市杭錦后旗市場購買。將干凈的葫蘆籽放入DZF-6250真空干燥器（上海友誼儀器有限公司）中，在60 ℃和25 kPa下干燥24 h，達到2 g/100 g的含水量。研磨后，葫蘆籽通過0.425 mm篩，密封在密封袋中，儲存在4 ℃直到提取。正己烷[國藥試劑公司（上海市），色譜純]。其他試劑（包括叔丁醇、硫酸銨、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、苯酚、硫酸）均購自國藥試劑公司（上海市），分析純。

1.2 葫蘆籽組分分析

參照AOCS[5]的標(biāo)準(zhǔn)方法分析了葫蘆籽的水分、油和蛋白質(zhì)含量，參照AOAC[6]的標(biāo)準(zhǔn)方法分析了灰分含量。葫蘆籽粉的含油量為46.17±0.11 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為30.25±0.23 g/100 g，初始含水量為9.43±0.11 g/100 g，總灰分含量為5.54±0.16 g/100 g。

1.3 UTPP提取CSO，CSP，CSPS工藝

葫蘆籽漿是通過將葫蘆籽粉與蒸餾水以1∶20（g/mL）混合來制備的。在室溫下，將一定比例的(NH4)2SO4（10～50 g/100 mL）添加到葫蘆籽混合物中，并輕輕攪拌使其充分混合。使用0.1 mol/L鹽酸溶液和0.1 mol/L NaOH溶液將混合物的pH調(diào)節(jié)至3～7。然后，按體積比（叔丁醇/漿液=0.5∶1.0～2.5∶1.0）加入叔丁醇。

使用20 kHz頻率的鈦超聲波探頭對混合物進行超聲處理，該探頭浸入樣品溶液中，距底部1.5 cm的深度。在脈沖模式下，混合物處理一定時間（5～25 min），同時保持一定的超聲波功率（30～150 W）和一定的占空比（20%～100%）。為了避免定位效應(yīng)，使用圓底玻璃反應(yīng)器。用冰浴冷卻系統(tǒng)，使所有樣品的溫度保持在25 ℃以下。超聲處理后，將混合物以7 600×g離心20 min，形成界限分明的三相。對上層溶劑層進行負壓蒸發(fā)以回收叔丁醇，并將獲得的CSO樣品儲存在4 ℃下。CSO提取率按式（1）計算。

CSO提取率=葫蘆籽提取物中油脂的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中油脂的含量（g/100 g）×100% （1）

中間層主要由沉淀的CSP和脫脂葫蘆籽組成，并記錄中間相的體積。將中間層的沉淀物溶解在pH 8.0的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，在4 ℃放置超過12 h，并在蒸餾水中透析，然后將上清液冷凍干燥以獲得CSP。獲得的CSP儲存在4 ℃下，以供進一步研究。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線由考馬斯亮藍比色法制備。CSP提取率按式（2）計算。

CSP提取率=葫蘆籽提取物中蛋白的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中蛋白的含量（g/100 g）×100% （2）

下層水相主要由CSPS和(NH4)2SO4組成。首先記錄所獲得的下層溶液的體積，用蒸餾水透析并冷凍干燥以獲得CSPS。CSPS儲存在4 ℃下，供后續(xù)研究使用。用苯酚-硫酸法（以d-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)）測定樣品在波長490 nm處的吸光度，計算出樣品中CSPS的含量，進而計算出葫蘆籽多糖的提取率。CSPS提取率按式（3）計算。

CSPS提取率=葫蘆籽提取物中多糖的含量（g/100 g）/所用的葫蘆籽顆粒原料中多糖的含量（g/100 g）×100% （3）

1.4 響應(yīng)面法的優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇響應(yīng)面法中的Box-Behnken試驗設(shè)計進行參數(shù)優(yōu)化，以獲得最佳響應(yīng)值。以超聲功率（A）、輻照時間（B）和占空比（C）為自變量，以CSO提取率（R1）、CSP提取率（R2）和CSPS提取率（R3）為響應(yīng)值，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面試驗，設(shè)計概要見表1。通過軟件（Design Expert 8.0.6，USA）分析二次多項式模型的系數(shù)。使用ANOVA進行統(tǒng)計分析以獲得UTPP的最佳條件。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素和水平

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 添加(NH4)2SO4的影響

在TPP系統(tǒng)中，(NH4)2SO4是最常用的鹽析試劑，因為它便宜，對蛋白質(zhì)溫和，并且具有高溶解度[10]。如圖1（A）所示，隨著(NH4)2SO4的添加量從10 g/100 mL增加到50 g/100 mL，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，這是因為鹽析效應(yīng)隨著體系中鹽濃度的增加而變得更強。(NH4)2SO4的最佳濃度將使蛋白質(zhì)絮凝并將其分離到相間，最大限度地釋放與蛋白質(zhì)結(jié)合的脂質(zhì)，從而最大限度地溶解叔丁醇相中的脂質(zhì)[7]。因此，當(dāng)(NH4)2SO4濃度為30 g/100 mL時，CSO提取率和CSP提取率最高，分別為38.99%和14.27%。然而，在較低的(NH4)2SO4添加量（20 g/100 mL）下，鹽的增溶作用可以促進CSPS在下相中的有效分配。因此，當(dāng)(NH4)2SO4的加入量為20 g/100 mL時，CSPS提取率最高，為2.05%。

圖1 UTPP法測試參數(shù)對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響

(NH4)2SO4濃度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)不可逆變性，不利于油體中蛋白質(zhì)和脂類的分離，導(dǎo)致CSO提取率和CSP提取率下降。同時，隨著(NH4)2SO4添加量的增加，CSPS提取率也降低，這是因為隨著鹽離子濃度的增加，鹽離子結(jié)合了更多的水分子，導(dǎo)致與水分子之間形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò)減弱，進而影響多糖的提取[7]。

(NH4)2SO4濃度為30 g/100 mL時，CSO提取率和CSP提取率最高，而(NH4)2SO4濃度為20 g/100 mL和30 g/100 mL時，CSPS提取率之間的差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇濃度為30 g/100 mL的(NH4)2SO4進行進一步研究。

2.2 叔丁醇與漿液比例的影響

叔丁醇是TPP中常見的溶劑，具有良好的水溶性，可以有效分離蛋白質(zhì)、色素、脂質(zhì)等各種生物分。如圖1（B）所示，當(dāng)叔丁醇與漿液的體積比從0.5∶1.0（mL/mL）增加到1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率逐漸增加。叔丁醇濃度的增加促使沉淀的蛋白質(zhì)漂浮在下層水相（含水的鹽層）之上，這促進了蛋白質(zhì)與脂質(zhì)和多糖的分離，同時促進了CSO在叔丁醇中的溶解。因此，當(dāng)叔丁醇與漿液的體積比為1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO、CSP和CSPS的提取率最高，分別為39.74%，14.17%和1.94%。

當(dāng)叔丁醇與漿液的體積比繼續(xù)增加到2.5∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率沒有顯著變化，而CSP提取率和CSPS提取率均下降。這是因為大量叔丁醇導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，這不利于蛋白質(zhì)沉降到相間[8]。隨著叔丁醇含量的增加，它與硫酸根離子競爭水分子，因此影響CSPS在下相中的溶解。結(jié)果表明，在漿液和叔丁醇的比例為1∶1時，可可脂替代品的提取率最高[9]。當(dāng)叔丁醇與漿液的體積比為1.0∶1.0（mL/mL）時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率達到最大值，因此選擇叔丁醇與漿液的體積比1.0∶1.0（mL/mL）進行進一步研究。

2.3 pH的影響

UTPP的分離效率與pH的變化高度相關(guān)。由于pH的變化會影響大分子之間的靜電相互作用，因此UTPP系統(tǒng)中蛋白質(zhì)和多糖的分配會隨著pH的變化而變化。在圖1（C）中，隨著pH從3增加到7，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。在pH 5時，最大的CSO提取率和CSP提取率分別為38.99%和14.17%，而在pH 6時最大的CSPS提取率為2.06%。一些研究結(jié)果顯示，CSP在pH約為5.0時溶解度最低。當(dāng)體系pH約為5時，CSP的凈電荷為零，蛋白質(zhì)的沉淀量最大，有利于油體中油和蛋白質(zhì)的分離，進而促進CSO在叔丁醇中的溶解。因此，CSO提取率和CSP提取率在pH 5時達到最大值。

隨著pH的增加，蛋白質(zhì)表面帶負電荷，這將增加蛋白質(zhì)在下層相中的溶解度，對油和蛋白質(zhì)的提取不利。因此，隨著pH繼續(xù)增加，CSO提取率和CSP提取率逐漸降低。pH的變化也會影響與多糖結(jié)合的糖蛋白的分離，從而影響CSPS提取率。CSO提取率和CSP提取率在pH 5時達到最大值，而在pH 5和pH 6時對CSPS提取率的影響的可變性不顯著（P＞0.05）。考慮到pH對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，選擇pH 5作為研究的下一步。

2.4 超聲波功率的影響

超聲波功率對提取效率有積極的貢獻。超聲功率的增加放大了空化效應(yīng)和機械剪切，促進了傳質(zhì)，有利于快速萃取。如圖1（D）所示，隨著超聲功率從30 W增加到150 W，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)超聲功率為120 W時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率達到最高值，分別為38.99%，14.17%和1.94%，這是由超聲波產(chǎn)生的聲空化現(xiàn)象引起的。在超聲波處理過程中，瞬態(tài)氣泡在幾個聲學(xué)周期內(nèi)迅速形成，當(dāng)它們在介質(zhì)中達到臨界尺寸時會強烈破裂，這種現(xiàn)象增加了空化區(qū)域的局部壓力，并在液體周圍產(chǎn)生高剪切和湍流，這加速了傳質(zhì)過程[7,9-10]，因此有利于CSO、CSP和CSPS的提取。然而，當(dāng)超聲功率過高時，空化氣泡劇烈破裂，導(dǎo)致空化效應(yīng)的中斷，因此CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率減少。CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率在120 W的超聲功率下達到最大值。因此，選擇120 W的超聲功率用于進一步研究。

2.5 輻照時間的影響

研究了超聲處理時間對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，結(jié)果顯示在圖1（E）中。如圖1（E）所示，當(dāng)超聲處理時間為15 min時，CSP提取率達到最大值2.01%，而CSO提取率和CSPS提取率在超聲處理時間為20 min時達到最高值，分別為38.99%和14.17%。超聲波輔助提取可以在短時間內(nèi)實現(xiàn)物質(zhì)的有效提取，這是由于超聲的瞬時空化效應(yīng)破壞了生物膜和細胞壁，促進了溶劑和固體之間的有效接觸，并使溶劑滲透到細胞中，從而加速了TPP的分離效率。因此，它有利于充分提取CSO，CSP和CSPS，并縮短提取時間[7,10]。CSO提取率和CSP提取率在照射時間為20 min時達到最大值。15和20 min的照射時間對細胞毒性的影響差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)合輻照時間對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的影響，選擇20 min的輻照時間用于進一步研究。

2.6 占空比的影響

考慮到換能器的腐蝕和由此產(chǎn)生的過熱，研究人員不建議連續(xù)使用超聲波。因此，為該系統(tǒng)選擇超聲波處理的脈沖模式，并表示為占空比。通過改變超聲波開啟和關(guān)閉時間來改變占空比。如圖1（F）所示，當(dāng)占空比從20%增加到100%時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率都顯示出先增加后減少的趨勢。占空比為60%時，CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率值最高，分別為38.99%，14.17%和1.94%。超聲處理產(chǎn)生的空化氣泡的破裂會在周圍流體中引起高溫、高壓和微射流的瞬態(tài)。當(dāng)占空比為20%（即脈沖間隔延長）時，微射流的這種狀態(tài)迅速消失。因此，較低的占空比不利于CSO、CSP和CSPS的提取。當(dāng)占空比增加時，系統(tǒng)中的固體和液體顆粒在超聲處理下振蕩并獲得更快的速度，導(dǎo)致可溶性物質(zhì)從原料快速擴散到溶劑中，從而促進CSO、CSP和CSPS的提取[8]。

超聲作用引起的空泡潰滅可產(chǎn)生高達5 000 K的局部溫度和高達1 000 MPa的壓力。當(dāng)占空比達到100%時，連續(xù)超聲作用產(chǎn)生的熱量難以迅速擴散，導(dǎo)致局部溫度過高，不利于CSO、CSP和CSPS的提取。此外，使用脈沖超聲治療比連續(xù)超聲治療更節(jié)能。為了優(yōu)化UTPP同時提取CSO、CSP和CSPS的超聲處理參數(shù)，對超聲功率、輻射時間和占空比三個自變量進行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗。其他操作條件：(NH4)2SO4的加入量為30 g/100 mL，叔丁醇與漿液的比例為1.0∶1.0（mL/mL），pH為5。

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化CSO、CSP和CSPS提取

2.7.1 干擾分析

將獨立變量組合到響應(yīng)曲線中，利用擾動圖研究了這3個變量對CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率的擾動影響。試驗自變量對響應(yīng)值的影響與曲線的斜率密切相關(guān)。斜率較大的響應(yīng)曲線意味著相應(yīng)的試驗因子對響應(yīng)值敏感，而斜率較小的曲線表明響應(yīng)值對該因子不敏感。在繪制過程中，通過改變測試范圍內(nèi)的單個因素并固定其他因素來檢查響應(yīng)值與參考點的偏差。圖2顯示占空比和超聲功率比照射時間對CSO提取率更敏感。圖2中的曲線表明，照射時間和占空比對CSP提取率更敏感，對于CSPS提取率，照射時間最敏感，占空比不太敏感。

圖2 測試參數(shù)對擾動的影響

2.7.2 響應(yīng)面模型分析

采用BBD法對超聲功率、輻射時間和占空比參數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件。17次運行的試驗數(shù)據(jù)和RSM模型的預(yù)測數(shù)據(jù)如表2所示，二次模型的ANOVA值如表3所示。如表3所示，“缺乏擬合P值”不顯著（P＞0.05），回歸分析顯著，F(xiàn)值分別為84.12，88.06和30.25，表明三個因素與響應(yīng)值之間存在顯著的非線性關(guān)系。模型的R平方值分別為0.990 9，0.991 2和0.975 4，adj的R平方值分別為0.979 2，0.980 0和0.943 7，充分證明了模型與試驗擬合良好?！癆deq精度”值分別為28.958，26.862和14.229，也表明該模型是理想的。所有三個模型的變異系數(shù)（C.V.）都小于5%，這代表了模型的良好再現(xiàn)性。

表2 RSM模型的測試數(shù)據(jù)和預(yù)測數(shù)據(jù)比較

表4 回歸方程方差分析

2.7.3 UTPP法提取參數(shù)的優(yōu)化

基于響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化的試驗條件為超聲功率117.57 W，輻射時間19.75 min，占空比62.37%。在最佳條件下，預(yù)測值分別為39.85%，14.32%和1.99%。結(jié)合實際操作，將超聲功率、輻照時間和占空比分別調(diào)整為118 W、20 min和60%。為了驗證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在調(diào)整后的條件下進行3次試驗驗證，得到的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率分別為39.79%±1.54%，14.30%±0.37%和1.97%±0.13%。驗證試驗結(jié)果與預(yù)測值高度一致，表明該模型能有效預(yù)測試驗結(jié)果。

3 結(jié)論

研究了用UTPP同時提取和分離葫蘆籽油、蛋白質(zhì)和多糖的效果。通過單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化了硫酸銨添加量、叔丁醇與漿液的比例、pH、超聲功率、輻射時間和占空比等參數(shù)，以實現(xiàn)CSO、CSP和CSPS的高效提取。當(dāng)(NH4)2SO4加入量為30 g/100 mL，叔丁醇與漿料的比例為1.0∶1.0（mL/mL），pH為5，超聲功率為118 W，輻射時間為20 min，占空比為60%時，獲得最高的CSO提取率、CSP提取率和CSPS提取率。工藝分析和優(yōu)化結(jié)果表明，占空比和超聲功率對CSPS提取率的影響比輻照時間更敏感，占空比和輻照時間對CSP提取率的影響更敏感，輻照時間對CSPS提取率的影響最敏感。同時，試驗結(jié)果與預(yù)測值吻合較好，表明該模型可用于指導(dǎo)實驗設(shè)計。與TPP方法相比，UTPP方法提取時間縮短，UTPP方法提取的CSO質(zhì)量較好。天然植物油一般具有抑制刺激，醇和煙香的作用；多糖具有改善口感，增加豐滿度的作用。利用自主調(diào)香技術(shù)對葫蘆籽油和葫蘆籽多糖的香味特征進行了修飾及優(yōu)化，進一步提升了葫蘆籽油和葫蘆籽多糖的品質(zhì)和作為香精在卷煙中的實用性。