扎蘭屯東北野生蒲公英黃酮提取工藝

趙玉娟，姜雷，孫雨辰*

扎蘭屯職業(yè)學(xué)院農(nóng)林工程系（扎蘭屯 162650）

蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.）為多年生草本菊科植物，又名婆婆丁、黃花三七、華花郎等[1]。蒲公英的根、莖、葉、花中含有很多天然植物特有的生物活性成分，主要包括多糖[2]、黃酮、萜類[3]、甾醇類、香豆素類、酚酸等[4-5]。蒲公英既可食用，又可藥用，應(yīng)用價(jià)值廣泛、市場(chǎng)前景廣闊[6]。蒲公英中的主要活性成分——黃酮類化合物清除自由基的效果很好，可防止體內(nèi)不飽和脂肪酸過(guò)量氧化，是一種天然的抗氧化劑，其可作為防治腫瘤及心腦血管疾病的有效藥物，無(wú)不良反應(yīng)[4-5]。參考相關(guān)文獻(xiàn)，利用超聲波輔助提取法，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，提取扎蘭屯東北野生蒲公英中黃酮，確定扎蘭屯東北野生蒲公英中黃酮的最優(yōu)提取工藝，對(duì)該地區(qū)蒲公英的加工利用起到一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

長(zhǎng)白山野生蒲公英根。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平（Bs224s，賽多利斯有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（SOV-140A，北京凱維豐科技發(fā)展有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH-600，上海一科儀器有限公司）；超聲清洗機(jī)（KQ-500VDE，昆山市超聲儀器有限公司）；粉碎機(jī)（BL200，南京沃拓實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司）；紫外可見分光光度計(jì)（UV-1600，日本Shimadzu公司）。

1.3 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、硝酸銀（上海化工有限公司）；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（國(guó)藥試劑有限公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 黃酮提取率計(jì)算

1.4.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]

準(zhǔn)確量取5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加入少量的50%無(wú)水乙醇加熱至充分溶解，移入25 mL標(biāo)準(zhǔn)容量瓶中，定容后，密封干燥備用，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。取7支10 mL量瓶，分別緩慢加入0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL對(duì)照液，再分別緩慢加入蒸餾水至5 mL，混合、搖勻和溶解后分別緩慢加入0.4 mL準(zhǔn)量的5%無(wú)水亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6 min，分別準(zhǔn)確量取0.4 mL 10%硝酸鋁溶液緩慢加入上面的量瓶中，搖勻后靜置約6 min，再分別準(zhǔn)確量取4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液加入上面量瓶中，用適當(dāng)?shù)恼麴s水補(bǔ)足、定容至刻度線，混合、搖勻后靜置20 min，以平行操作后的試劑溶液作為空白參比液，在506 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其紫外吸光度，以溶液質(zhì)量濃度（C，mg/mL）為橫坐標(biāo)X，吸光度（A）為縱坐標(biāo)Y，分別繪制吸收回歸曲線圖，計(jì)算出吸收回歸的曲線方程。

1.4.1.2 黃酮提取率的計(jì)算

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求出蒲公英根黃酮提取率，按式（1）計(jì)算[8]。

式中：C為提取液中黃酮類化合物質(zhì)量濃度，mg/mL；V為被測(cè)液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為蒲公英根質(zhì)量，g。

1.4.2 蒲公英根預(yù)處理

將清洗、干燥好的蒲公英根放入炒制機(jī)，在150℃炒制30 min左右，以炒制出焦香味為準(zhǔn)。將炒制好的蒲公英根用粉碎機(jī)粉碎，粉碎后過(guò)0.425 mm孔徑（40目）篩，反復(fù)幾次，將粉碎好的原料，裝盒備用。準(zhǔn)確稱取試驗(yàn)用量蒲公英粉末進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理?xiàng)l件：超聲功率130 W，時(shí)間25 min。

1.4.2.1 提取溫度對(duì)蒲公英黃酮提取率的影響

將預(yù)處理蒲公英根分成5份，放入燒杯中，在溫度分別為50，60，70，80和90 ℃條件下，將蒲公英根溶液進(jìn)行加熱浸提，提取時(shí)間與料液比分別固定為2 h和1∶30 g/mL，提取后用0.125 mm孔徑（100目）濾紙進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后提取液按式（1）計(jì)算蒲公英根黃酮的提取率。

1.4.2.2 提取時(shí)間對(duì)蒲公英黃酮提取率的影響

將預(yù)處理蒲公英根分成5份，放入燒杯，在提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h的條件下，蒲公英根溶液進(jìn)行加熱浸提，提取溫度和料液比分別固定為70 ℃和1∶30 g/mL，提取后用0.125 mm孔徑（100目）濾紙進(jìn)行抽濾。過(guò)濾后提取液按式（1）計(jì)算蒲公英根黃酮的提取率。

1.4.2.3 料液比對(duì)蒲公英黃酮提取率的影響

將預(yù)處理的蒲公英根分成5份，放入燒杯中，在料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50和1∶60 g/mL條件下，蒲公英根溶液進(jìn)行加熱回流提取，提取溫度與時(shí)間分別固定為70 ℃和2 h，提取后用0.125 mm孔徑（100目）濾紙進(jìn)行抽濾。過(guò)濾后提取液按式（1）計(jì)算蒲公英根黃酮的提取率。

1.4.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素提取試驗(yàn)研究結(jié)果，以蒲公英根黃酮類化合物提取率為響應(yīng)值，以提取料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）為自變量，做提取試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)。如表1所示。

表1 提取試驗(yàn)因素水平表

對(duì)影響蒲公英根黃酮提取率的料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行3個(gè)因子水平正交試驗(yàn)研究。如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮含量測(cè)定中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為y=1.024 5x+0.0007，R2=0.999 2，線性關(guān)系良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同提取溫度對(duì)提取率的影響

如圖2所示，在其他條件固定時(shí)，隨著溫度水平的升高，黃酮提取率呈現(xiàn)先提升后降低的變化趨勢(shì)。提取溫度達(dá)到70 ℃左右時(shí)，提取率達(dá)到最大值7.24%。

圖2 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.2 不同提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

如圖3所示，在其他條件固定時(shí)，隨著提取時(shí)間的逐漸增加，黃酮提取率呈現(xiàn)先提升后降低的變化趨勢(shì)。提取時(shí)間2 h時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值7.55%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

2.2.3 不同料液比對(duì)提取率的影響

如圖4所示，在其他條件固定時(shí)，隨著液體占比的逐步增大，黃酮提取率呈現(xiàn)先提升后降低的變化趨勢(shì)。料液比1∶50（g/mL）時(shí)，黃酮提取率達(dá)到最大值10.81%。

圖4 料液比對(duì)黃酮提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)

由表3可知，影響黃酮提取率高低變化規(guī)律的各項(xiàng)因素中存在一種顯著性順序，其主次順序?yàn)橐蛩谹＞因素C＞因素B，即料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度。

3 討論

蒲公英是我國(guó)一種能夠藥食療兼用型的優(yōu)質(zhì)天然野生植物，具有潛在的醫(yī)學(xué)藥用研究?jī)r(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健應(yīng)用價(jià)值，其藥用有效成分之一是黃酮類成分[9]，其中東北蒲公英總黃酮含量為5.33%[9]。蒲公英全株中的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、降血脂、抗炎、抗癌、抑菌、提高人類機(jī)體免疫力等多種天然藥理活性。吳穎等[10]研究表明蒲公英黃酮具有良好的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性；周學(xué)東等[11]研究表明蒲公英原藥中的黃酮類物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)因子IL-1β和IL-6實(shí)現(xiàn)對(duì)胃炎治療，其改善效果很好；王曉英[12]通過(guò)研究證實(shí)，蒲公英黃酮水提物可以導(dǎo)致細(xì)菌失去正常的生理功能，從而起到抑菌功效，這種功效是通過(guò)阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；薛長(zhǎng)暉等[13]研究表明，蒲公英黃酮及其銅絡(luò)合物可以去除致癌物質(zhì)，從而預(yù)防癌癥；史易暖[14]研究表明蒲公英提取物可能通過(guò)選擇性調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TIMP-2的基因表達(dá)及功能變化，從而進(jìn)一步控制乳腺癌MCF-7細(xì)胞基因表達(dá)的異常突變，抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力；孫立陽(yáng)等[15]研究表明，用蒲公英黃酮制成的酸奶產(chǎn)品，可顯著提升小鼠體液的免疫能力。

國(guó)內(nèi)常用的蒲公英黃酮類化合物提取純化方法包括有機(jī)溶液提取純化法、雙水相萃取體系分離提取、微波輔助分離提取、超聲波輔助分離提取、柱層分離法及超臨界CO2分離萃取法[16]。許樂(lè)[17]通過(guò)醇提法得到的蒲公英黃酮提取率為6.59%，其最優(yōu)提取方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，固液比1∶20（g/mL），提取時(shí)間45 min。楊利民等[18]研究所得數(shù)據(jù)表明，最佳的雙水相提取的工藝方案分別為(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%，平均pH 5.34，平均提取溫度25 ℃，在此最優(yōu)方案條件下蒲公英的黃酮提取率平均值為5.47%。樊友[19]研究所得數(shù)據(jù)表明，乙醇提取過(guò)程中，用微波輔助提取，能夠縮短原料和乙醇的反應(yīng)時(shí)間，并且減少乙醇用量。在采用微波輔助的乙醇提取工藝最優(yōu)方案下，黃酮類化合物的提取量平均值為12.79 mg/g。同超聲波輔助提取法[20]相比較，其他幾種方法的提取過(guò)程較為復(fù)雜，用時(shí)較長(zhǎng)，而且需要的試劑較多進(jìn)而增加試驗(yàn)成本，并且提取時(shí)所用化學(xué)試劑有殘留的可能性，對(duì)于飲料的生產(chǎn)有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，而超聲波輔助法提取過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉，提取條件溫和，是一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)、綠色的提取方法，也是最常用的提取方法?；谏鲜鲈颍囼?yàn)采用超聲波輔助提取法從蒲公英根中直接提取黃酮類化合物。

在超聲功率130 W預(yù)處理?xiàng)l件下，采用最優(yōu)的提取方案（料液比1∶50 g/mL、提取時(shí)間2 h、提取溫度70℃）提取蒲公英根中黃酮類化合物，測(cè)得蒲公英根黃酮的提取率平均值為11.47%。因?yàn)樵囼?yàn)采用的超聲波輔助法為物理方式的提取法，提取過(guò)程并未使用有機(jī)溶劑，有利于蒲公英復(fù)合飲料研發(fā)及生產(chǎn)實(shí)際需要，并且所得黃酮提取率處于中上水平，對(duì)后續(xù)蒲公英飲料的研究具有重要意義。

4 結(jié)論

通過(guò)超聲波輔助法，提取得到蒲公英根中的黃酮，在超聲功率130 W條件下，采用單因素分析法結(jié)合正交試驗(yàn)分析，得到蒲公英根黃酮最優(yōu)的提取方案：料液比1∶50（g/mL）、提取時(shí)間2 h、提取溫度70 ℃。在此最優(yōu)條件下，蒲公英根黃酮提取率為11.47%。