木霉菌對向日葵幼苗生理特性及菌核病防治效果的影響

廉 華，陳玉蓉，李 梅，李潤哲，張 渟，馬光恕

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081)

向日葵(HelianthusannuusL.)屬于菊科菊亞科向日葵屬植物，其耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1]。向日葵是在我國栽培面積僅次于大豆、油菜和花生的油料作物，也是我國華北北部、東北地區(qū)和西北地區(qū)具有地區(qū)特色和優(yōu)勢的重要經(jīng)濟(jì)作物[2]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織對世界各國向日葵年度種植面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2019年世界向日葵年度種植面積2 736.88萬 hm2，總產(chǎn)量5 607.27萬 t，中國向日葵種植面積和總產(chǎn)量分別為85.00萬 hm2和242.00萬 t[3]，居世界第6位，可見我國對世界向日葵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展貢獻(xiàn)很大。隨著各國人民的生活水平逐漸提高，對向日葵籽粒及其副產(chǎn)品的需求也不斷增加，向日葵種植面積逐年加大。

向日葵菌核病是由病原真菌核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的，該病害在全球各向日葵種植地區(qū)幾乎都有發(fā)生[4]。在中國東北、內(nèi)蒙古等產(chǎn)區(qū)，向日葵菌核病平均發(fā)病率為40%～60%，最高可達(dá)90%以上[5]，嚴(yán)重影響向日葵產(chǎn)量和品質(zhì)，制約向日葵產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前，對向日葵菌核病的防治主要采用農(nóng)業(yè)防治、選育抗病品種、化學(xué)防治和生物防治等措施，但是農(nóng)業(yè)防治和篩選抗病品種周期長，耗時(shí)耗力[6]；化學(xué)防治雖然效果顯著，但常伴隨病菌抗藥性增強(qiáng)、農(nóng)藥殘留、食品安全和環(huán)境污染等問題[7]。生物防治是當(dāng)前提倡的防控向日葵菌核病的重要措施[8]，木霉(Trichodermaspp.)是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的生防真菌類型之一。

木霉菌是屬于真菌界、雙核菌門、半知菌亞門、絲孢綱叢、梗孢目、叢梗孢科、木霉屬的一種真菌[9]，Ahmad等[10]研究表明，木霉菌通過分泌植物生長激素等物質(zhì)促進(jìn)植物生長。利用木霉防治向日葵菌核病的研究已有少量報(bào)道，Mathews等[11]研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉在減少向日葵菌核形成方面具有較大潛力；曹翠玲等[12]通過對峙培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，康氏木霉(Trichodermakoningii)對向日葵菌核病菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，對病原菌的抑制率達(dá)41.4%；于秀英等[13]通過溫室盆栽試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌對向日葵幼苗期菌核病有明顯防效，成苗率達(dá)到75%，而對照只有34%；王春等[14]研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌株M1M2發(fā)酵液對向日葵菌核病菌菌絲抑制率為82.6%，盆栽防效為73.8%，田間防效為60.0%。但這些研究具有局限性，或只研究了木霉菌對核盤菌菌絲的抑制作用，或只進(jìn)行了溫室盆栽的防效試驗(yàn)，研究結(jié)果不夠系統(tǒng)。本研究擬采用平板對峙試驗(yàn)篩選出對向日葵菌核病有顯著防治效果的木霉菌株，系統(tǒng)研究木霉菌不同施用方式對向日葵幼苗生長、生理特性及對向日葵菌核病防治效果的影響，為木霉菌劑研發(fā)和推廣提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試向日葵品種 供試品種為‘豐葵雜1號’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊試驗(yàn)基地提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0～7.2，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后備用。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 ml，pH自然，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后備用。

1.1.3 供試菌株 供試菌株編號及其名稱見表1，木霉菌菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所木霉菌研究組提供。

表1 供試木霉菌菌株Table 1 Test strains of Trichoderma spp.

向日葵菌核病病原菌：核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所土傳病害生物防治研究組提供。

1.1.4 供試土壤 將營養(yǎng)土和蛭石按照4∶1均勻混合。營養(yǎng)土壤基本理化性狀為：全氮183.41 mg·kg-1，堿解氮137.785 mg·kg-1，全磷13.29 mg·kg-1，速效鉀198.63 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)56.32 g·kg-1，pH值7.31。

1.2 防治菌核病木霉菌篩選

將木霉菌株接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)3 d；將向日葵菌核病菌接種于PDA平板，28℃培養(yǎng)5 d。用6 mm打孔器分別打取培養(yǎng)好的木霉菌和向日葵菌核病菌菌落邊緣菌塊接種于PDA平板，距平板邊緣 1 cm處相對放置，28℃培養(yǎng)；以單獨(dú)接種向日葵菌核病原菌為對照，5次重復(fù)。培養(yǎng)5 d后測量病原菌生長半徑和對峙培養(yǎng)菌核病菌落生長半徑，參照馬文旭等[15]的方法，計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=(對照組菌落半徑-處理組菌落半徑)/對照組菌落半徑×100

1.3 木霉發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液的制備

1.3.1 木霉發(fā)酵液的制備 將木霉菌在PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅5塊，接種在含有100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)的250 mL的三角瓶中，在搖床28℃黑暗條件下振蕩(250 r·min-1)培養(yǎng)7 d，制成木霉發(fā)酵液。用血球記數(shù)板測定孢子數(shù)，并將木霉發(fā)酵液的孢子數(shù)調(diào)整為1.2×107個(gè)·mL-1備用。

1.3.2 核盤菌菌絲懸浮液的制備 將向日葵病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm 的菌餅5塊，接種在含有100 mL PD的250 mL三角瓶中，28℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d，用雙層紗布濾出菌絲團(tuán)，將菌絲攪碎，用無菌水調(diào)整濃度為1.2×107CFU·mL-1的菌絲懸浮液，備用。

1.4 木霉菌對向日葵生理特性影響和菌核病防治試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2021年5—8月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室內(nèi)開展。采用盆栽方式，將營養(yǎng)土和蛭石按照4∶1比例均勻混合，裝入塑料材質(zhì)的育苗盆(11.0 cm×11.5 cm×11.5 cm)中，每盆土重300 g。向日葵種子催芽后，每盆播種2粒，出苗后每盆保留1棵，置于陽光充足的地方，每隔1 d每盆澆無菌水100 mL。待植株長出4片真葉(即播種后20 d)，利用向日葵菌核病病原菌菌絲懸浮液灌根，每盆20 mL。利用1.2中方法篩選出的抑制率較高的5種木霉菌進(jìn)行處理。

試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)處理：(1)播種前5 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土+接種菌核病菌前2 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根，設(shè)為T1；(2)播種前5 d用200 mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土，設(shè)為T2；(3)接種菌核病菌前2 d用200 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根，設(shè)為T3；(4)單獨(dú)用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉菌懸浮液，設(shè)為CK1；(5)單獨(dú)用無菌水灌根且不施用向日葵菌核病菌和木霉菌懸浮液，設(shè)為CK2。每個(gè)處理設(shè)60盆，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。

1.4.2 測定指標(biāo)與方法 接種后15 d即播種后35 d，每個(gè)處理選取15株植株(每個(gè)重復(fù)5株)，用于測定向日葵幼苗形態(tài)指標(biāo)和物質(zhì)積累量指標(biāo)，計(jì)算根冠比；同時(shí)期每個(gè)處理另取30株(每個(gè)重復(fù)10株)，用于測定向日葵生理指標(biāo)和抗病性指標(biāo)。

(1)形態(tài)指標(biāo)：株高為植株的莖基部到生長點(diǎn)之間的距離，用直尺測定；莖粗為植株子葉節(jié)下1 cm處粗度，用游標(biāo)卡尺測定。

(2)物質(zhì)積累量指標(biāo)：清水反復(fù)沖洗植株后，用吸水紙吸干，將地上部(包括葉片、葉柄和莖)與地下部即根系部分分開后，分別測其鮮重并計(jì)算全株鮮重和根冠比。

根冠比=地下部鮮重/地上部鮮重

(3)生理指標(biāo)：包括丙二醛(MDA)含量、質(zhì)膜透性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸(Pro)含量、葉綠素含量。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[16]測定；質(zhì)膜透性參照張志良等[17]的方法，用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測定，用細(xì)胞膜相對透性表示：取0.5 g新鮮的向日葵葉片組織，用無菌蒸餾水沖洗干凈，濾紙吸干葉片表面水分，將葉片剪碎后置入50 mL小燒杯，加入30 mL蒸餾水，使葉片完全浸沒，靜置24 h，混勻后用電導(dǎo)儀測量燒杯內(nèi)液體的電導(dǎo)率，記為L1,讀取數(shù)值后，將燒杯內(nèi)水分煮沸5 min，冷卻至室溫，混勻后再測量電導(dǎo)率，記為L2，細(xì)胞膜相對透性(%)=L1/L2×100；可溶性糖含量采用蒽酮比色法[18]測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮蘭G-250染色法[19]測定；脯氨酸(Pro)含量參照閆蕾等[20]的方法，即酸性茚三酮顯色法測定；葉綠素含量采用丙酮乙醇法[21]測定。

(4)抗病性指標(biāo)：包括植株發(fā)病率、病情指數(shù)、防治效果。接種病原菌后第6 d開始調(diào)查植株發(fā)病情況，以后每隔1 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查5次。向日葵菌核病分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳嫻等[22]的方法，分為5級：0級表示無??；1級表示病斑面積占全葉10%以下；2級表示病斑面積占全葉10%～30%；3級表示病斑面積占全葉31%～50%；4級表示病斑面積占全葉51%以上。病情指數(shù)參照宗兆鋒等[23]的計(jì)算方法。

植株發(fā)病率為接種后15 d各處理發(fā)病株數(shù)占調(diào)查總株數(shù)的百分比。

病情指數(shù)= [∑(病級株數(shù)×代表級數(shù))/(植株總數(shù)×最高代表級值)]×100

防治效果(%)=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行圖表制作，試驗(yàn)數(shù)據(jù)取5次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，利用DPS 7.05(data processing system)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 防治菌核病木霉菌篩選

如表2所示，平板對峙拮抗篩選法試驗(yàn)獲得2株抑制率在90%以上的菌株，其中非洲哈茨木霉T.afroharzianum838抑制率最高，為91.86%；其次是棘孢木霉T.asperellum573，抑制率為91.23%。T.afroharzianum838和T.asperellum573之間差異不顯著但二者均顯著高于其他菌種，分別比哈茨木霉T.harzianum752、棘孢木霉T.asperellum940、棘孢木霉T.asperellum758、哈茨木霉T.harzianum1000、棘孢木霉T.asperellum647、哈茨木霉T.harzianum1042、棘孢木霉T.asperellum525、哈茨木霉T.harzianum1038高5.82%、7.61%、9.37%、15.68%、15.93%、23.17%、33.23%、33.83%和5.09%、6.88%、8.62%、14.88%、15.13%、22.33%、32.31%、32.91%。試驗(yàn)由此篩選出非洲哈茨木霉T.afroharzianum838和棘孢木霉T.asperellum573這2個(gè)木霉菌株進(jìn)行木霉菌對向日葵促生和防效影響的進(jìn)一步研究。

表2 木霉菌菌株篩選Table 2 Screening of Trichoderma strains

2.2 木霉菌對向日葵幼苗形態(tài)建成和物質(zhì)積累的影響

向日葵播種后35 d，非洲哈茨木霉T.afroharzianum838和棘孢木霉T.asperellum573對幼苗株高和莖粗影響如圖1所示。圖1A為T.afroharzianum838不同施用方式下向日葵幼苗株高和莖粗的表現(xiàn)，T1(播種前5 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土+接種菌核病菌前2 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根)的株高和莖粗最高，分別為18.9 cm和0.86 cm。T1與T2(播種前5 d用200 mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土)、T2與T3(接種菌核病菌前2 d用200 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根)之間的株高差異均不顯著，但T1、T2、T3顯著高于CK1(單獨(dú)用向日葵菌核病菌灌根且不施用木霉懸浮液)和CK2(單獨(dú)用無菌水灌根且不施用向日葵菌核病菌和木霉懸浮液)，分別高58.82%、47.90%、38.66%和36.96%、27.54%、19.57%；CK2株高顯著高于CK1，增幅為15.97%。T1莖粗顯著高于T2、T3、CK2、CK1，分別高14.67%、26.47%、86.96%、177.42%，處理之間差異均達(dá)顯著水平。圖1B為T.asperellum573不同施用方式下向日葵幼苗株高和莖粗的表現(xiàn)，T1的株高和莖粗最高，分別為17.6 cm和0.72 cm。T1與T2、T2與T3株高之間差異均不顯著，但T1、T2、T3均顯著高于CK1和CK2，分別高47.90%、37.82%、28.57%和27.54%、18.84%、10.87%；CK2株高顯著高于CK1，增幅為15.97%。T1莖粗顯著高于T2、T3、CK2、CK1，分別高14.29%、24.14%、56.52%、132.26%；T2與T3、T3與CK2之間差異均不顯著。CK1株高和莖粗最低，分別為11.9 cm和0.31 cm。說明同一木霉菌不同施用方式對向日葵幼苗株高和莖粗的作用效果也有差異。

注：圖中正負(fù)誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差大小。不同小寫字母表示在同一時(shí)期各處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note：Values in the chart are standard error. Different lowercase letters in the same period indicate significant difference(P<0.05)among different treatments. The same below．圖1 非洲哈茨木霉T. afroharzianum 838(A)和棘孢木霉 T. asperellum 573(B)對向日葵幼苗株高和莖粗的影響Fig.1 Effects of T. afroharzianum 838(A) and T. asperellum 573(B)on plant height and stem diameter of sunflower seedlings

相同施用方式下，非洲哈茨木霉T.afroharzianum838的T1、T2、T3的株高和莖粗均高于棘孢木霉T.asperellum573對應(yīng)處理方式，分別高7.39%、7.32%、7.84%和19.44%、19.05%、17.24%。

向日葵播種后35 d，T.afroharzianum838和T.asperellum573對幼苗全株鮮重和根冠比影響如圖2所示。圖2A為T.afroharzianum838不同施用方式下向日葵幼苗全株鮮重和根冠比的表現(xiàn)，T1全株鮮重和根冠比最高，分別為6.87 g和0.17。T1與T2、T2與T3之間的全株鮮重差異均不顯著，但T1、T2、T3均顯著高于CK1和CK2，分別高95.17%、78.98%、66.19%和63.57%、50.00%、39.29%；CK2全株鮮重顯著高于CK1，增幅為19.32%。T1根冠比顯著高于T2、T3、CK2、CK1，分別高13.33%、21.43%、30.77%、41.67%；T2、T3與CK2差異不顯著，但顯著高于CK1，分別高25.00%、16.67%；CK2、CK1之間差異不顯著。圖2B為T.asperellum573不同施用方式下向日葵幼苗全株鮮重和根冠比的表現(xiàn)，T1的幼苗全株鮮重和根冠比最高，分別為5.84 g和0.18。T1全株鮮重顯著高于T2、T3、CK2、CK1，分別高12.74%、19.92%、39.05%、65.91%；T2和T3之間差異不顯著，但二者均顯著高于CK2、CK1，分別高23.33%、47.16%和15.95%、38.35%；CK2全株鮮重顯著高于CK1，增幅為19.32%。T1根冠比顯著高于T2、T3、CK2、CK1，分別高12.50%、20.00%、38.46%、50.00%；T2與T3之間差異不顯著但二者均顯著高于CK1、CK2，分別高33.33%、23.08%和25.00%、15.38%；CK1與CK2根冠比之間差異不顯著。CK1全株鮮重和根冠比最低，分別為3.52 g和0.12。

圖2 非洲哈茨木霉T. afroharzianum 838(A)和棘孢木霉 T. asperellum 573(B)對向日葵幼苗全株鮮重和根冠比的影響Fig.2 Effects of T. afroharzianum 838(A) and T. asperellum 573(B) on whole plant fresh weight and root shoot ratio of sunflower seedlings

相同施用方式下，非洲哈茨木霉T.afroharzianum838的T1、T2、T3的全株鮮重均高于棘孢木霉T.asperellum573對應(yīng)處理方式，分別高17.64%、21.62%、20.12%；但二者之間根冠比差異很小。

綜上可知，木霉不同施用方式對向日葵幼苗株高、莖粗、全株鮮重和根冠比的作用效果有所不同，非洲哈茨木霉T.afroharzianum838的T1處理對向日葵幼苗形態(tài)建成和物質(zhì)積累促進(jìn)效果最強(qiáng)，為提高向日葵幼苗抗逆性提供了基礎(chǔ)保證。

2.3 木霉菌對向日葵幼苗葉片生理特性的影響

2.3.1 木霉菌對向日葵幼苗葉片丙二醛含量的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片丙二醛含量影響如圖3所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以CK1葉片丙二醛含量最高，為9.31 μmol·g-1。T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下CK1顯著高于CK2、T1、T2、T3，分別高79.38%、49.44%、30.21%、24.80%和79.38%、37.72%、27.36%、19.05%；T2和T3顯著高于CK2、T1，T.afroharzianum838處理下分別高37.76%、14.77%和43.74%、19.74%，T.asperellum573處理下分別高40.85%、8.14%和50.67%、15.68%；T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下T1顯著高于CK2，分別高20.04%和30.25%；CK2丙二醛含量最低，為5.19 μmol·g-1。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下丙二醛含量均低于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別降低7.84%、2.19%、4.60%。

圖3 木霉菌對向日葵幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of Trichoderma on malondialdehyde content of sunflower seedlings leaf

2.3.2 木霉菌對向日葵幼苗葉片細(xì)胞膜相對透性的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片細(xì)胞膜相對透性影響如圖4所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以CK1葉片細(xì)胞膜相對透性最高，為82.31%。T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下CK1顯著高于CK2、T1、T2、T3，分別高88.57%、53.22%、43.35%、30.11%和88.57%、46.75%、40.08%、25.88%。T.afroharzianum838的T3顯著高于T1和CK2，分別高17.76%、44.93%；T2與T1之間差異不顯著，二者均顯著高于CK2，分別高31.55%和23.07%。T.asperellum573的T3顯著高于T2、T1、CK2，分別高11.28%、16.58%、49.81%；T2與T1之間差異不顯著，均顯著高于CK2，分別高34.62%、28.50%；CK2葉片細(xì)胞膜相對透性最低，為43.65%。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下葉片細(xì)胞膜相對透性均低于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別降低4.23%、2.28%、3.26%。

圖4 木霉菌對向日葵幼苗葉片細(xì)胞膜相對透性的影響Fig.4 Effects of Trichoderma on cell membrane relative permeability of sunflower seedlings leaf

2.3.3 木霉菌對向日葵幼苗葉片可溶性糖含量的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片可溶性糖含量的影響如圖5所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以T1葉片可溶性糖含量最高，分別為42.07 mg·g-1和39.60 mg·g-1。T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下T1均顯著高于CK1、CK2、T2、T3，分別高179.91%、123.06%、14.23%、37.80%和163.47%、109.97%、20.99%、39.44%；T2、T3、CK2、CK1之間均呈顯著性差異，CK1葉片可溶性糖含量最低，為15.03 mg·g-1。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下葉片可溶性糖含量均高于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別高6.24%、12.53%、7.50%。

圖5 木霉菌對向日葵幼苗葉片可溶性糖含量的影響Fig.5 Effects of Trichoderma on soluble sugar content of sunflower seedlings leaf

2.3.4 木霉菌對向日葵幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響如圖6所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以T1葉片可溶性蛋白含量最高，分別為70.35 μg·g-1和65.44 μg·g-1。

圖6 木霉菌對向日葵幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effects of Trichoderma on soluble protein content of sunflower seedlings leaf

T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下T1均顯著高于CK1、CK2、T2、T3，分別高132.10%、87.05%、17.02%、34.41%和115.90%、74.00%、17.82%、33.41%；T2、T3、CK2、CK1之間均呈顯著性差異，CK1葉片可溶性蛋白含量最低，為30.31 μg·g-1。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下葉片可溶性蛋白含量均高于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別高7.50%、8.25%、6.71%。

2.3.5 木霉菌對向日葵幼苗葉片脯氨酸含量的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片脯氨酸含量的影響如圖7所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以T1葉片脯氨酸含量最高，分別為142.67 μg·g-1和131.85 μg·g-1。T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下T1均顯著高于CK1、CK2、T2、T3，分別高98.68%、66.63%、16.76%、35.70%和83.61%、53.99%、18.21%、35.02%；T2、T3、CK2、CK1之間均呈顯著性差異，CK1葉片脯氨酸含量最低，為71.81 μg·g-1。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下葉片脯氨酸含量均高于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別高8.21%、9.55%、7.67%。

圖7 木霉菌對向日葵幼苗葉片脯氨酸含量的影響Fig.7 Effects of Trichoderma on proline content of sunflower seedlings leaf

2.3.6 木霉菌對向日葵幼苗葉片葉綠素含量的影響T.afroharzianum838和T.asperellum573對向日葵幼苗葉片葉綠素含量的影響如圖8所示，向日葵播種后35 d，2個(gè)木霉菌均以T1的葉片葉綠素最高，分別為3.76 mg·g-1和3.52 mg·g-1。T.afroharzianum838和T.asperellum573處理下T1均顯著高于CK1、CK2、T2、T3，分別高129.27%、62.07%、10.59%、23.68%和114.63%、51.72%、8.64%、27.54%；T2、T3、CK2、CK1之間均呈顯著性差異，CK1的葉片葉綠素含量最低，為1.64 mg·g-1。T.afroharzianum838的T1、T2、T3處理下葉片葉綠素含量均高于T.asperellum573下的對應(yīng)處理，分別高6.82%、4.94%、10.14%。

圖8 木霉菌對向日葵幼苗葉片葉綠素含量的影響Fig.8 Effects of Trichoderma on chlorophyll content of sunflower seedlings leaf

綜上可知，木霉不同施用方式對向日葵幼苗葉片細(xì)胞膜相對透性以及丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量的作用效果有差異，非洲哈茨木霉T.afroharzianum838的T1處理通過降低向日葵幼苗葉片中的丙二醛和細(xì)胞膜相對透性，提高可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量，增強(qiáng)了抗氧化系統(tǒng)的功能和生理活性，提高了對菌核病的防治效果。

2.4 木霉菌對盆栽向日葵菌核病防治效果的影響

向日葵播種后35 d，調(diào)查各處理菌核病的發(fā)病率，計(jì)算病情指數(shù)和防治效果，結(jié)果如表3所示。各處理發(fā)病率以CK1最高，為97.58%；以T.afroharzianum838的T1處理發(fā)病率最低，為2.56%。病情指數(shù)與發(fā)病率的規(guī)律一致，也以CK1最高，為57.50；以T.afroharzianum838的T1處理最低，為0.83。木霉菌對菌核病的防治效果以T.afroharzianum388的T1處理最高，為98.55%；T.afroharzianum838的T1處理與T.asperellum573的T1處理之間差異不顯著，但二者均顯著高于T.afroharzianum838的T2、T3處理、T.asperellum573的T2、T3處理以及CK2，分別高3.03%、4.62%、6.25%、7.94%、41.67%和1.52%、3.08%、4.69%、6.35%、39.58%；T.afroharzianum838的T2和T3處理之間差異不顯著，二者均顯著高于T.asperellum573的T2、T3處理以及CK2，分別高3.13%、4.76%、37.50%和1.56%、3.17%、35.42%；T.asperellum573的T2、T3處理之間差異不顯著但二者均顯著高于CK2，分別高33.33%和31.25%；CK2的防治效果最低，為69.57%。說明木霉種類和施用方式均對向日葵菌核病的防治效果有一定影響，生產(chǎn)上選擇適宜的木霉施用方式對提高菌核病防效具有一定積極作用。

表3 木霉菌對向日葵菌核病防效的影響Table 3 Effects of the control efficiency of Trichoderma against Sclerotinia sclerotiorun of sunflower

3 討 論

由核盤菌引起的菌核病是造成向日葵產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的主要病害之一，該病害在世界各地向日葵種植區(qū)均有發(fā)生[24]。長期使用化學(xué)殺菌劑不僅會造成農(nóng)藥殘留污染，還會危害果實(shí)及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量安全[25]，甚至?xí)T導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性，影響向日葵的使用價(jià)值和商品價(jià)值。生物防治已成為向日葵菌核病防治的主要方法。如朱林等[26]利用平板對峙試驗(yàn)篩選出對向日葵核盤菌有抑制作用的NM63、JQ134、J7、Z9、J33和ZX6共6種菌株，拮抗菌Z9和ZX6鑒定為鏈霉菌屬(Streptomyces)，拮抗菌NM63、JQ134、J7和J33鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)；盆栽試驗(yàn)表明菌株NM63、JQ134、J7、Z9、J33和ZX6單菌劑的防治效果分別為79.06%、74.10%、70.72%、67.83%、65.11%和57.11%，復(fù)合發(fā)酵菌劑Ⅰ(Z9∶NM63∶JQ134∶J7=1∶1∶1∶1)和復(fù)合發(fā)酵菌劑Ⅱ(Z9∶NM63∶JQ134∶J7=1∶2∶2∶1)的防治效果分別為81.43%和85.88%，防效優(yōu)于單菌劑。而本試驗(yàn)中篩選出的T.afroharzianum838和T.asperellum573木霉菌株，其3種不同施用方式對盆栽向日葵菌核病的防效均在93.84%以上，高于文獻(xiàn)報(bào)道，說明本研究篩選的木霉菌株具有一定的市場開發(fā)前景。

木霉不僅能直接拮抗植物病原微生物，還具有促進(jìn)幼苗生長、提高植株生理代謝水平的作用[27]。Zhao 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TrichodermaafroharzianumTM2-4具有產(chǎn)生生物活性物質(zhì)和促進(jìn)番茄種子萌發(fā)的作用，其培養(yǎng)濾液經(jīng)100倍稀釋處理后，番茄下胚軸長度、根長和活力指數(shù)分別提高了28.7%、19.4%和62.1%；Yani等[29]研究發(fā)現(xiàn)，利用木霉(Trichodermaspp)處理的大蒜株高、根長和塊莖重量分別較對照增加0.8%、9.0%～23.0%、21.0%～51.0%，使用木霉生物制劑可以提高大蒜產(chǎn)量。本研究顯示，與CK1相比，T.afroharzianum838和T.asperellum573的3種處理方式均降低了向日葵幼苗葉片丙二醛和細(xì)胞膜相對透性，降低幅度分別為19.05%～49.44%、25.88%～53.22%；提高了葉片可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量，提高幅度分別為88.96%～179.91%、61.83%～132.10%、35.98%～98.68%、68.29%～129.27%。同時(shí)，T.afroharzianum838和T.asperellum573的3種處理方式均提高了向日葵幼苗株高、莖粗、全株鮮重、根冠比，提高幅度分別為28.57%～58.82%、87.10%～177.42%、38.35%～95.17%、16.67%～50.00%。這是因?yàn)槟久雇ㄟ^調(diào)節(jié)植物生理生化代謝過程，影響了幼苗的生長狀態(tài)[30]，從而促進(jìn)了植株生長[31]。

4 結(jié) 論

非洲哈茨木霉T.afroharzianum838和棘孢木霉T.asperellum573不同施用方式通過提高向日葵幼苗生理特性，促進(jìn)了其形態(tài)建成和物質(zhì)積累，增強(qiáng)了向日葵對菌核病的抗性。其中以非洲哈茨木霉T.afroharzianum838的T1處理(播種前5 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液拌土+接種菌核病菌前2 d用100 mL·盆-1木霉菌懸浮液灌根)應(yīng)用效果最好，向日葵播種后35 d，該處理植株葉片中的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和葉綠素含量分別比CK1提高179.91%、132.10%、98.68%、129.27%，MDA含量、細(xì)胞膜相對透性分別比CK1降低49.44%、53.22%；幼苗株高、莖粗、全株鮮重、根冠比分別比CK1提高58.82%、177.42%、595.17%、41.67%；其對向日葵菌核病的防效達(dá)到98.58%。