應用二次通用旋轉組合設計禾長蠕胞菌制劑配方

張建萍 段桂芳 楊爽 余柳青 陸永良 唐偉*

（1 中國水稻研究所/水稻生物育種全國重點實驗室，杭州 310006；2 上海曉明檢測技術服務有限公司，上海 201612；第一作者：zhangjianping@caas.cn；*通訊作者：tangwei@caas.cn）

雜草是影響水稻高產穩(wěn)產的有害生物因子，目前主要依賴化學除草劑進行防治[1]。長期大量使用化學除草劑不僅造成生態(tài)環(huán)境破壞，還導致雜草產生抗藥性[2]。微生物除草劑具有對環(huán)境友好等特點，是化學農藥的有益補充或替代品。微生物除草劑，如真菌菌絲體、孢子等作為防治制劑使用的基本原理是用病原菌感染靶標雜草，以抑制雜草生長達到防治雜草的目的[3]。在這個過程中宿主、病原菌和環(huán)境因子對雜草防治效果都有很重要的影響，因此，需要篩選到高除草活性真菌菌株，并在適宜的環(huán)境下施用才能達到好的防治效果。

禾長蠕孢菌（Helminthosporium gramineumRabenh.f.sp．echinochloae，簡稱HGE）是從自然感病稗草上分離到的一種絲狀真菌，能有效感染稗草、鴨舌草等雜草，但對水稻、小麥等主要作物安全，具有開發(fā)為稻田生物除草劑的潛力[4-6]。然而，HGE 在田間應用時易受環(huán)境因子，包括溫度、濕度以及紫外線的影響而降低活性甚至失活。研制劑型是解決實驗室高效菌株在田間應用防效下降問題的有效途徑，也是將實驗室效果轉化為田間應用的基礎保證[7]。為此，本研究在前期研究的基礎上[8-10]，采用二次通用旋轉組合設計HGE 孢子制劑配方，并進行田間小區(qū)試驗驗證，為其進一步開發(fā)和商品化生產提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和稗草

HGE 分離于自然感病稗草[4]，保藏于中國水稻研究所。供試稗草種子采集于中國水稻研究所試驗田，曬干后-20 ℃冷凍保藏備用。

1.2 培養(yǎng)基

PDB 培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯20%，葡萄糖2%，蒸餾水。PDA 培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基添加1.7%瓊脂粉。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基I：米粉4%，豆粕粉1%，Na3PO4·12H2O 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%。

1.3 菌種活化和轉接體制備

將4 ℃斜面保存的HGE 轉接到新鮮PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d 活化。將活化的禾長蠕胞菌株轉接PDB 培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 后制成菌懸液備用。

1.4 孢子粉制備

稱取1.5 L（約106.5 g）珍珠巖置于托盤中，添加4%米粉、1%豆粕粉、0.2% Na3PO4·12H2O、0.1% MgSO4·7H2O、40%蒸餾水，充分攪拌混合均勻，121 ℃高溫滅菌40 min。培養(yǎng)基冷卻后，接入8%HGE 懸液，用無菌玻棒攪拌均勻。用8 層無菌紗布覆蓋托盤口，用橡皮筋固定。置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，期間用黑光燈12 h 循環(huán)光照誘導產孢。14 d 后收集獲得孢子粉。

1.5 稗草

將稗草種子在溫室中浸泡2 d，催芽露白后，挑選發(fā)芽較好的稗草種子（50 粒左右）播種于0.25 m2圓形小盆中，溫室培育至2.0~3.0 葉期，備用。

1.6 試驗設計

為篩選HGE 孢子制劑配方，在單因素試驗結果[10]的基礎上，將孢子粉按比例與增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑混合均勻，配制成孢子粉劑，噴施于2.0~3.0葉期稗草上，14 d 后測定稗草株高和鮮質量防效，以稗草死亡率為考察指標，采用二次通用旋轉組合實驗設計，篩選增效劑（X1）、溶劑油（X2）、穩(wěn)定劑（X3）和乳化劑（X4）這4 個因素的最佳配比，確定HGE 孢子制劑配方。其中，增效劑選用種類、零水平和間隔設計參考耿銳梅[11]的研究結果，混合使用增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）+增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）。二次通用旋轉組合實驗因素水平編碼表和結構矩陣見表1 和表2。

表1 二次通用旋轉組合試驗因素及水平表

1.7 稗草防效測定

將HGE 孢子粉與各助劑按照表2 配制，孢子粉制劑施用方法為噴霧法。用壓力噴霧器對稗草葉片均勻噴灑孢子懸液100 mL/m2。將噴完藥的稗苗繼續(xù)在溫室培養(yǎng)，14 d 后實測取樣法調查稗草株高、鮮質量和死亡率。試驗共設置25 個處理，分別為二次通用旋轉組合試驗設計的20 個處理，以及清水對照、不添加任何助劑的孢子粉對照、10%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照、20%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照和30%田間常規(guī)用量的增效劑A+增效劑B 對照。每個處理3 次重復，試驗重復3 次。

表2 二次通用旋轉組合試驗結構矩陣

1.8 數(shù)據(jù)處理

二次通用旋轉組合試驗結果用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)統(tǒng)計分析[12]。

2 結果與分析

2.1 HGE孢子制劑對稗草的防效

HGE 孢子制劑對稗草的株高和鮮質量防效以及稗草死亡率見表3。對2.0~3.0 葉期稗草只噴施孢子粉處理時，稗草的死亡率為0，稗草株高和鮮質量防效也僅為3.11%和7.78%。而在孢子粉中添加不同比例助劑的20 個處理，株高防效、鮮質量防效及稗草死亡率均優(yōu)于單獨噴施孢子粉的對照處理，表明在HGE 孢子粉中添加助劑能有效提高其對稗草的防治效率。

表3 HGE 孢子制劑對稗草防效 （單位：%）

2.2 回歸方程的建立與檢驗

二次通用旋轉組合實驗方案及結果如表4 所示。增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑、乳化劑4 個因素對稗草死亡率相互作用所得方差分析結果詳見表5。

利用DPS 分析軟件對實驗結果進行分析，得到二次回歸方程為：

回歸方程顯著性檢驗結果如表4 所示。剔除不顯著項后，得到回歸方程（2）：

表4 二次通用旋轉組合實驗設計與結果

由表5 可見，回歸方程失擬檢驗F1=1.69967（p=0.3514），差異不顯著，說明控制因素對實驗結果影響較小，可以進一步對回歸方程進行擬合檢驗。顯著性檢驗F2=24.62342（p=0.0001），達到極顯著水平，說明方程與實際情況擬合良好，能夠反應除草效果（死亡率）與增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑的關系。

2.3 主因子效應分析

由表5 可見，回歸方程一次項對稗草死亡率的影響顯著，其中增效劑對稗草死亡率的影響達到極顯著水平（p=0.000077<0.01），溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑對稗草死亡率也有顯著影響（p<0.05）。回歸方程的偏回歸系數(shù)（即偏相關）絕對值的大小可以判明各決定因子的重要程度，系數(shù)的正負表示因子效應作用的方向[12]。因此，各因素在實驗取值范圍內對稗草死亡率作用大小依次為：X1（增效劑）> X4（乳化劑）> X2（溶劑油）> X3（穩(wěn)定劑），其中X2為負效應，其余3 個因素均為正效應。

2.4 單因子效應分析

將4 個因素中的3 個固定在零水平，對數(shù)學模型進行降維分析，得到以其中1 個因素為決定變量的偏回歸方程：

上述4 個方程其二次項系數(shù)都是負值，說明其表征的效應曲線均是一條開口向下的拋物線，即隨著增效劑、溶劑油、穩(wěn)定劑和乳化劑用量的不斷增加，死亡率將表現(xiàn)出先增后減的趨勢，說明這4 個因素均存在最佳值，用量太高或太低都影響其對稗草的防治效果。

2.5 互作效應分析

對數(shù)學模型的方差分析表明，交互項X1X2的p值>0.05，說明增效劑與溶劑油之間的交互作用對稗草死亡率沒有顯著影響。交互項X1X3和X1X4均達到顯著水平（p值均小于0.05），其中X1X4達到極顯著水平，說明增效劑與穩(wěn)定劑、增效劑與乳化劑之間的交互作用對稗草死亡率有顯著影響（表5）。

2.6 變量輪換直接尋優(yōu)

根據(jù)已建立的數(shù)學模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）范圍內，每個因素取5 個水平（±1.682，±1 和0），對54=625 個方案進行統(tǒng)計尋優(yōu)，在試驗范圍內可得稗草最大死亡率為100%，此時各因素取值為：X1=1.682，X2=-1，X3=1.682，X4=-1.682，對應著4 種助劑的用量是：1 g 孢子粉中添加8.28 mg 增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）、33 μL 增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）、0.25 mL 大豆油、0.5523 g 羧甲基纖維素鈉和0.0318 g SP-20。

2.7 頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)

變量輪換直接尋優(yōu)法可求出優(yōu)化配方組合，但沒有考慮到隨機因素，在實際生產中很難實現(xiàn)。采用計算機對不同設計水平下的組合進行模擬試驗，以孢子制劑對稗草殺草活性80% 作為臨界值，獲得大于臨界值的方案有34 個，各變量取值的頻率分布見表6。表6 顯示在95%置信區(qū)間、稗草死亡率大于80%的優(yōu)化方案：增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56~8.10 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26~32 μL，大豆油添加量為0.21~0.33 mL，羧甲基纖維素鈉添加量為0.49~0.53 g，SP-20 添加量為0.09~0.23 g。

表6 優(yōu)化方案中Xi 取值頻率分布表

然而，在現(xiàn)實農業(yè)生產中，微生物除草劑中化學除草劑的添加量越少越好，只要能夠保證微生物除草劑的田間藥效在80%以上即可；穩(wěn)定劑用量也不應很多，因為在加水噴霧時，穩(wěn)定劑太多可能會影響制劑在水中分散性。綜合考慮各種影響因素后獲得最終優(yōu)化配方為：增效劑用量為常規(guī)用量的30%，即增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26 μL，大豆油添加量為0.25 mL，羧甲基纖維素鈉添加量為0.49 g，SP-20 添加量為0.10 mL。

對此配方進行試驗驗證，結果發(fā)現(xiàn)該制劑配方在溫室對稗草殺草活性為100%，與理論值相符，同時對水稻生長沒有負面影響，進一步證實了優(yōu)化配方的可行性。

3 結論與討論

微生物除草劑具有對生態(tài)環(huán)境友好、不易產生抗藥性等優(yōu)點，但田間除草效率較低，不如化學除草劑見效快、防效好[13-14]。這是因為微生物除草劑活性成分易受環(huán)境因子影響而失活或降低感染效率，再加上有些微生物除草劑對靶標雜草具有特性選擇性，通常不能將田間雜草全部除掉，而是將雜草控制在一定閾值內，但對作物生長沒有影響。因此，本試驗采用二次通用旋轉組合設計優(yōu)化HGE 孢子制劑配方時，對靶標稗草防效定于80%，通過頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)求得在95% 的置信區(qū)間稗草死亡率大于80%的方案有34 個，在這34 個優(yōu)化方案中，4 種助劑的添加量被縮小到一定范圍，在此范圍內對目標雜草防效的理論值就應在80%以上，從中篩選獲得符合實際生產應用的最佳制劑配方。

二次通用旋轉組合設計可以在減少試驗次數(shù)的同時獲得較為準確的結果。該試驗方法已經被研究人員廣泛應用于優(yōu)化數(shù)據(jù)、模型的模擬與預測中[15-17]。因本試驗數(shù)據(jù)量大，為保證試驗精度，提高試驗效率，特選用此方法優(yōu)化制劑配方中各助劑的添加量。研究結果表明，建立的數(shù)學模型擬合檢驗極為顯著，說明方程與實際情況擬合良好，對于稗草死亡率的因子效應分析具有實際意義。4 種助劑對稗草死亡率作用大小依次為：X1（增效劑）>X4（乳化劑）>X2（溶劑油）>X3（穩(wěn)定劑）。其中，增效劑對稗草死亡率影響極顯著，溶劑油大豆油、穩(wěn)定劑CMC 和乳化劑SP-20 對稗草死亡率影響顯著。頻率分析及統(tǒng)計尋優(yōu)求得在95% 的置信區(qū)間稗草死亡率大于80%的優(yōu)化方案。綜合生產實際應用，將優(yōu)化方案確定為：增效劑用量大約為常規(guī)用量的30%，即增效劑A（10%吡嘧磺隆WP）添加量為6.56 mg，增效劑B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量為26 μL，大豆油添加量為0.25 mL，CMC 添加量為0.49 g，SP-20 添加量為0.10 mL。

微生物除草劑與低劑量化學除草劑復配有益于微生物除草劑商品化推廣應用，這是因為二者混配后產生的菌藥協(xié)同作用能降低其使用劑量，增強微生物除草劑控草效率[18]，還可改變真菌寄主選擇性，擴大殺草譜[7]。PENG 等[19]報道，混合使用40%推薦劑量與亞劑量（2.3×107孢子/mL）真菌Pyricularia setariaeNiskada 孢子就能夠完全控制狗尾草，僅添加10%或40%推薦劑量的烯禾啶后，能有效增強真菌對大齡狗尾草的防治效率。HEINY[20]報道，真菌（Phoma proboscis）與2,4-D和MCPA 混配后在田間能有效防治田旋花。本試驗根據(jù)前期研究篩選到的對HGE 孢子相容性較好的化學除草劑五氟磺草胺和吡嘧磺隆，通過優(yōu)化方案確定只需推薦用量的30%，即可有效提高HGE 除草效率，起到增效劑的作用，為今后HGE 孢子制劑的推廣應用奠定了基礎。