貽貝豆醬發(fā)酵工藝對其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及抗氧化性的影響

郭麗平，閆 文，2，戴志遠(yuǎn)，2，3*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310035 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310035 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116000）

貽貝是一種分布廣泛的海洋雙殼貝類，又叫青口，被譽(yù)為“海上雞蛋”，富含蛋白質(zhì)、維生素、微量元素和?；撬岬瘸煞郑瑺I養(yǎng)和藥用價(jià)值極高[1-2]。貽貝的養(yǎng)殖成本低，生命力強(qiáng)，我國海水養(yǎng)殖貽貝產(chǎn)量居世界前列[3]。然而，貝類的采捕期短，目前主要以鮮銷和干制品為主，產(chǎn)品形式單一，限制了貽貝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。

近年來，隨著人們對食品的需求由安全營養(yǎng)型到風(fēng)味型、天然型和功能型的轉(zhuǎn)變，充分利用水產(chǎn)品資源生產(chǎn)高品質(zhì)復(fù)合天然系調(diào)味料越來越重要[5]。典型的水產(chǎn)調(diào)味料有蠔油、魚露、蟹醬、蝦醬等，除了種類齊全、配比合理的氨基酸，貝類牛磺酸和活性肽有助于人體健康[6]。目前，對水產(chǎn)調(diào)味料的開發(fā)，大部分集中在酶解和發(fā)酵兩種手段，酶解工藝雖簡單，但產(chǎn)品腥味難以消除，市場接受度較低[7]。發(fā)酵能夠產(chǎn)生豐富酶系，且有一定的脫腥效果，但利用貽貝發(fā)酵的相關(guān)報(bào)道較少。

本文以冷凍貽貝肉、黃豆、大米為原料，采用米曲霉制曲后混合發(fā)酵，通過單因素實(shí)驗(yàn)確定貽貝豆醬的適宜發(fā)酵條件，并對發(fā)酵前、后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及抗氧化性變化進(jìn)行評價(jià)，旨在為開發(fā)貽貝發(fā)酵產(chǎn)品提供參考。對于提高貽貝資源利用水平，增加其附加值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、大米、食鹽，杭州市教工路物美超市；醬油曲精，久微食品科技（上海）有限公司；冷凍貽貝肉，浙江省嵊泗縣華利水產(chǎn)有限公司。

甲醛水溶液、0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、2-甲基-3-庚酮（分析純級）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪、鄰-羥基苯甲酸、四水合氯化亞鐵、乙氧烷，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC 高壓蒸汽滅菌器，松下健康醫(yī)療器械株式會社；BSA124S-CW 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HS-1300U 型超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；Bluepard 恒溫恒濕箱、電熱培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ST3100/F 臺式PH 計(jì)，奧豪斯儀器（常州）有限公司；SPECTRA MAX 190 酶標(biāo)儀，美國分子儀器有限公司；紫外-可見分光光度計(jì)、Trace GC ultra 氣相色譜-DSQ II 質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Theremo Fisher Scientific 公司；DP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 貽貝豆醬的制備方法 貽貝豆醬的制備方法如下：

操作要點(diǎn)如下：先分別制豆曲和米曲，曲精接種溫度40 ℃，接種量為原料質(zhì)量的0.01%，在恒溫31 ℃、濕度≥85%的條件下培養(yǎng)，至表面呈嫩黃綠色收曲。后加入貽貝肉和食鹽，拌勻后恒溫混料發(fā)酵一定時(shí)間，經(jīng)研磨和巴氏殺菌后成貽貝豆醬成品。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以氨基酸態(tài)氮含量及感官評分作為評價(jià)指標(biāo)，分別考察食鹽添加量、曲貝質(zhì)量比、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素對貽貝豆醬品質(zhì)的影響。

1.3.2.1 食鹽含量對貽貝豆醬品質(zhì)的影響 在曲貝質(zhì)量比1 ∶1、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間21 d 的條件下，設(shè)定不同的食鹽添加量（10%，12%，14%，16%，18%）。

1.3.2.2 曲貝質(zhì)量比對貽貝豆醬品質(zhì)的影響 在食鹽添加量14%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵時(shí)間21 d的條件下，設(shè)定不同的曲貝質(zhì)量比（1∶4，1∶2，1∶1，

2∶1，4 ∶1 ）。

1.3.2.3 發(fā)酵溫度對貽貝豆醬品質(zhì)的影響 在曲貝質(zhì)量比為1∶1、食鹽添加量14%、發(fā)酵時(shí)間21 d的條件下，設(shè)置不同的發(fā)酵溫度（30，35，40，45，50℃）。

1.3.2.4 發(fā)酵時(shí)間對貽貝豆醬品質(zhì)的影響 在曲貝質(zhì)量比為1∶1，食鹽添加量14%，發(fā)酵溫度40℃的條件下，設(shè)置不同的發(fā)酵時(shí)間（15，18，21，24，27 d）。

1.3.3 氨基酸態(tài)氮含量的測定 采用GB 5009.235-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[8]中酸度計(jì)法。

1.3.4 感官評定 采用感官量化描述分析法（Quantitative description analysis，QDA），挑選8名經(jīng)過訓(xùn)練的食品專業(yè)研究生組成的感官評定小組進(jìn)行測評，對貽貝豆醬的感官特性進(jìn)行評價(jià)。貽貝豆醬的感官指標(biāo)主要從色澤、體態(tài)、氣味、滋味4 個(gè)方面來評定，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 貽貝豆醬感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria of mussel bean paste

1.3.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

1.3.5.1 頂空固相微萃取條件 研磨貽貝豆醬進(jìn)樣量4 g，培育溫度70 ℃保持40 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維頭，老化溫度250 ℃，解吸時(shí)間10 min，自動進(jìn)樣。

1.3.5.2 氣相色譜條件 進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流；載氣：氦氣（純度99.99%）；流速1.0 mL/min；色譜柱：DP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：40 ℃保持2 min；以4 ℃/min 升至92 ℃，保持2 min；5 ℃/min 升至200 ℃，保持0 min；6 ℃/min 升至240 ℃，保持6 min。

1.3.5.3 質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源，電離電壓70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍33～450 u。

1.3.5.4 定性與定量分析 采用NIST 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，選擇正反匹配度大于750 的化合物進(jìn)行定性分析；依據(jù)化合物峰面積比值與質(zhì)量濃度呈正比的原理，計(jì)算每一種化合物相對于內(nèi)標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度。未知揮發(fā)性化合物含量按下式計(jì)算。

式中，Cx——未知揮發(fā)性化合物含量，g/kg；Co——內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，g/μL；Vo——內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)樣體積，μL；Sx——未知揮發(fā)性化合物的峰面積，AU·min；So——添加的內(nèi)標(biāo)化合物峰面積，AU·min；m——樣品質(zhì)量，kg。

1.3.6 體外抗氧化性的測定 參照趙曉娟[9]的方法，分別稱取5.0 g 發(fā)酵前、后貽貝豆醬樣品，加入100 mL 60%乙醇溶液均質(zhì)后浸提30 min，并用60%乙醇溶液稀釋成10，20，30，40 mg/mL 的質(zhì)量濃度，分別測定總抗氧化能力、羥自由基（·OH）清除率。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，利用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和顯著性分析，利用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝豆醬發(fā)酵工藝單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 食鹽添加量對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響 氨基酸態(tài)氮是指以氨基酸形式存在的氮元素，是判定發(fā)酵產(chǎn)品發(fā)酵程度的特性指標(biāo)，該指標(biāo)越高，產(chǎn)品鮮味越好，品質(zhì)越高[10]。由圖1可知，隨著食鹽添加量由10%上升到18%，貽貝豆醬氨基酸態(tài)氮含量從0.86 g/100 g 逐漸降低至0.53 g/100 g。各組氨基酸態(tài)氮含量均符合不低于0.3g/100 g 的國家標(biāo)準(zhǔn)[11]。隨著食鹽添加量的增加，貽貝豆醬的感官評分呈先升高后降低的趨勢。食鹽在發(fā)酵過程中既可防腐抑菌保證產(chǎn)品質(zhì)量，也可篩選對發(fā)酵有益的嗜鹽或耐鹽微生物，影響水解酶活性，從而影響發(fā)酵進(jìn)程[12]。食鹽添加量較低時(shí)，貽貝豆醬的氨基酸態(tài)氮含量雖然較高，但有酸味，這可能是因?yàn)樘砑拥氖雏}較少，未能有效抑制腐敗或產(chǎn)酸微生物[13]，而過高的食鹽添加量使水分活度降低，抑制了微生物代謝以及水解酶活性，氨基酸態(tài)氮含量減少。在食鹽添加量為14%時(shí)，貽貝豆醬無酸敗氣味，海鮮香氣協(xié)調(diào)，且咸甜適中，口感醇厚，呈黃棕褐色且透亮有光澤，體態(tài)黏稠適中，均勻細(xì)膩，感官評分最高。因此，確定食鹽添加量為14%。

圖1 食鹽添加量對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effects of salt content on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.2 曲貝質(zhì)量比對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖2 可知，隨著曲貝質(zhì)量比增大，貽貝豆醬的氨基酸態(tài)氮含量由0.68 g/100 g 逐漸下降至0.45 g/100 g，感官評分則呈現(xiàn)倒“V”型趨勢。各組感官評分差異顯著的原因在于貝肉與曲料在發(fā)酵過程中的作用不一，且二者成分差異較大。貝肉主要提供發(fā)酵原料蛋白質(zhì)等，其水分含量高；而曲料主要作為發(fā)酵劑的載體，身上附著大量酶系與少量微生物[14]，其水分含量較低。曲貝質(zhì)量比為1∶4，1∶2 時(shí)，發(fā)酵劑不足，發(fā)酵不完全，發(fā)酵后貽貝豆醬較稀不成型，色澤偏向黃綠色，腥味濃郁，感官不可接受。曲貝質(zhì)量比為2∶1，4∶1 時(shí)，貽貝豆醬體態(tài)黏稠，呈黑棕色且無光澤，發(fā)酵海鮮香味淡。因此，確定曲貝質(zhì)量比為1∶1，此時(shí)貽貝豆醬的氨基酸態(tài)氮含量適中，感官評分達(dá)89 分。

圖2 曲貝質(zhì)量比對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of trabecula proportion on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.3 發(fā)酵溫度對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖3 可知，隨著溫度上升，貽貝豆醬的氨基酸態(tài)氮含量呈先升高后降低又回升，各組氨基酸態(tài)氮含量均遠(yuǎn)超過醬類國家最低氨基酸態(tài)氮限量標(biāo)準(zhǔn)；感官評分則呈現(xiàn)明顯的先上升后下降的趨勢，在40 ℃時(shí)感官評分最高。溫度不僅是保證微生物生長及酶系作用的重要前提[15]，還與氧化反應(yīng)、Strecker 降解和美拉德反應(yīng)、酯化反應(yīng)及微生物代謝等生成風(fēng)味物質(zhì)的生化反應(yīng)有關(guān)[16]。綜上，40 ℃是貽貝豆醬最適宜的發(fā)酵溫度條件。

圖3 發(fā)酵溫度對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響 由圖4 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，貽貝豆醬的感官評分與氨基酸態(tài)氮含量均呈先升高后降低的趨勢。發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的酶系水解原料，積累風(fēng)味前體物質(zhì)的水解反應(yīng)與生成風(fēng)味物質(zhì)的復(fù)雜生化反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行[17]。發(fā)酵第15 天時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量較低，總體感官不可接受，可能是處于風(fēng)味前體物質(zhì)已經(jīng)積累，而大量的風(fēng)味物質(zhì)還未形成的階段。發(fā)酵進(jìn)行到第24 天時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高為0.84 g/100 g，感官評分也達(dá)到最高。繼續(xù)發(fā)酵至第27 天時(shí)，數(shù)值略有下降。推測原因是受到蛋白酶活力下降，微生物代謝及美拉德等反應(yīng)的影響，氨基酸態(tài)氮及風(fēng)味物質(zhì)積累的速度低于分解的速度有關(guān)，這與王沛[18]、王雪梅[19]的研究結(jié)果一致。故確定發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)間為24 d。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對貽貝豆醬感官及氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.2 發(fā)酵對貽貝豆醬揮發(fā)性風(fēng)味成分及含量的影響

發(fā)酵前、后共檢測到71 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括芳香化合物類、醇類、酯類、醛類、酚類、含氮化合物、含硫化合物和烴類共8 個(gè)種類。發(fā)酵前揮發(fā)性物質(zhì)共34 種，總含量為4 633.48 μg/kg，發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)共55 種，總含量為6 397.01 μg/kg，發(fā)酵前后揮發(fā)性成分差異顯著（P＜0.05）。

醇類一般是與脂肪酸的氧化或羰基化合物還原相關(guān)，低碳醇揮發(fā)性好，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[20]。檢測到發(fā)酵前、后醇類物質(zhì)種類均為5 種，經(jīng)過發(fā)酵，貽貝豆醬醇類物質(zhì)相對含量12.7%下降至5.8%。醇類是醛酮類的前體物質(zhì)，對貽貝豆醬的風(fēng)味具有加和作用[21]。

醛類揮發(fā)性物質(zhì)涉及到化學(xué)變化主要是發(fā)酵過程中的脂肪酸氧化反應(yīng)以及氨基酸代謝反應(yīng)[20]。醛類的閾值低于醇類，且具有重疊風(fēng)味的效應(yīng)[22]。發(fā)酵前檢測到貽貝豆醬醛類物質(zhì)4 種，發(fā)酵后增加了4 種，含量是發(fā)酵前的3.6 倍。主要增加的風(fēng)味物質(zhì)異戊醛、2-甲基丁醛、10-十八碳烯醛、苯甲醛、苯乙醛、硬脂烷醛的特征香氣分別是醬油味和蘋果香、麥芽香、水果香、杏仁香、花香及水果香氣[23]。醛類占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對含量由發(fā)酵前的7.5%升高到發(fā)酵后18.5%，對貽貝豆醬風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)。發(fā)酵后異戊醛、2-甲基丁醛、苯乙醛的含量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其氣味閾值0.25，0.9 μg/kg 及9 μg/kg[24]，是貽貝豆醬特征性風(fēng)味的主要成分。

酯類物質(zhì)主要由微生物利用醇和酸進(jìn)行酯化作用產(chǎn)生，揮發(fā)性強(qiáng)且氣味閾值低，短鏈酯通常具有水果和花香等令人愉悅的氣味，長鏈酯通常具有油脂味[25]。經(jīng)米曲霉發(fā)酵處理后，貽貝豆醬中酯類物質(zhì)的相對含量由26.5%增至45.9%，種類由13 種增至20 種。其中，肉豆蔻酸乙酯、癸酸癸酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯等酯類物質(zhì)使貽貝豆醬香氣醇厚。此外，貽貝豆醬中還檢測到亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯以及二十碳五烯酸甲酯。

芳香化合物是食用香料的重要來源，主要由芳香族氨基酸降解產(chǎn)生，氣味閾值一般較高[26]。發(fā)酵后芳香化合物的種類由3 種增至13 種，相對含量從13.6%下降至12.3%。貽貝豆醬中的芳香化合物大部分歸屬于苯類、萜烯類及雜環(huán)化合物（吲哚、唑）類芳香化合物[27]。烴類物質(zhì)主要來源于脂肪或者氨基酸的氧化，是肉類風(fēng)味物質(zhì)的中間體，基本無香氣[28]。

表2 貽貝豆醬發(fā)酵前、后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成與含量占比Table 2 Composition and content of volatile compounds before and after fermentation of mussel bean paste

（續(xù)表2）

（續(xù)表2）

2.3 發(fā)酵對貽貝豆醬體外抗氧化性的影響

FRAP 法可以體現(xiàn)體系內(nèi)的總抗氧化能力[29]，是常用的評估體系抗氧化能力的指標(biāo)。由圖5所示，隨著質(zhì)量濃度的增加，貽貝豆醬發(fā)酵前后的總抗氧化能力均不斷上升，未發(fā)酵貽貝豆醬的總抗氧化能力由7.54 mmol FeSO4/g 上升至42.39 mmol FeSO4/g，發(fā)酵后貽貝豆醬總抗氧化能力由26.71 mmol FeSO4/g 升高至129.52 mmol FeSO4/g。同一質(zhì)量濃度下，發(fā)酵后貽貝豆醬的總抗氧化能力是未發(fā)酵組的3 倍左右，二者呈明顯的正相關(guān)，這說明發(fā)酵能夠使貽貝豆醬體系中的抗氧化物質(zhì)增多，總抗氧化能力增強(qiáng)。

圖5 貽貝豆醬浸提液的總抗氧化能力Fig.5 Effect of mussel bean paste extracts on total antioxidant capacity

羥自由基被認(rèn)為是目前已知的氧化能力最強(qiáng)和危害性最大的活性氧之一，與機(jī)體衰老、腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[30]。由圖6 可知，發(fā)酵前、后貽貝豆醬均有一定的清除羥自由基的能力，說明貽貝豆醬中含有能夠阻止羥自由基產(chǎn)生的物質(zhì)。隨質(zhì)量濃度的增大，發(fā)酵前、后兩組貽貝豆醬羥自由基清除率分別由7.4%和16.2%增大至32.6%和74.0%。同一質(zhì)量濃度下，發(fā)酵組羥自由基清除率均是未發(fā)酵組的3 倍左右。以上結(jié)果表明羥自由基清除率與質(zhì)量濃度線性相關(guān)，且發(fā)酵可以大大增強(qiáng)貽貝豆醬的羥基自由基清除能力。此結(jié)論與武悅等[31]關(guān)于黑豆丹貝抗氧化性的研究結(jié)果一致。

圖6 貽貝豆醬浸提液的羥自由基清除率Fig.6 Effect of mussel bean paste extracts on hydroxyl radical scavenging rate

3 結(jié)論

利用貽貝、黃豆等為主要原料，醬油曲精為發(fā)酵劑，混料發(fā)酵制備貽貝豆醬，并探究了發(fā)酵前、后貽貝豆醬的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及體外抗氧化性的變化。通過單因素實(shí)驗(yàn)確定發(fā)酵條件為：食鹽含量為14%，曲貝質(zhì)量比1 ∶1，發(fā)酵溫度40 ℃，發(fā)酵24 d。制得的貽貝豆醬氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.84 g/100 g，感官品質(zhì)較好。經(jīng)過發(fā)酵，貽貝豆醬的香氣種類及相對含量更為豐富。原料的貽貝原料腥味以及豆腥味減輕，海鮮風(fēng)味、豆醬香味得到豐富。發(fā)酵使貽貝豆醬的羥自由基清除能力、FRAP總抗氧化能力顯著增強(qiáng)。后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步研究貽貝豆醬發(fā)酵過程中的生化動態(tài)及風(fēng)味物質(zhì)變化，以期為貽貝豆醬的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。