TWEAK/Fn14在結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損組織中的表達

羅邁，彭雪婷，王思佳，劉瑋，顧漢江，陸美，王亞琦，夏育民

結(jié)節(jié)性紅斑(erythema nodosum, EN)是一種發(fā)生于皮下脂肪間隔的慢性炎癥性疾病，好發(fā)于年輕女性，皮損多發(fā)生于下肢，主要表現(xiàn)為對稱分布的鮮紅色結(jié)節(jié)、斑塊，自覺疼痛和壓痛。結(jié)節(jié)性紅斑可分為特發(fā)型和繼發(fā)型兩大類，大多數(shù)患者為特發(fā)型，病因不明；繼發(fā)型多與真菌感染、惡性腫瘤、妊娠、口服避孕藥相關(guān)[1]。組織病理學表現(xiàn)為皮下脂肪間隔內(nèi)炎癥細胞浸潤、脂肪肉芽腫、小葉間隔受累及毛細血管增生。結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病機制復雜，目前尚未完全明確[2-3]。

腫瘤壞死因子樣弱凋亡誘導因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)主要由炎癥浸潤組織中巨噬細胞等炎癥細胞合成分泌，其唯一受體成纖維細胞生長誘導因子14(fibroblast growth factor-inducible 14, Fn14)結(jié)合TWEAK后可激活下游信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。TWEAK/Fn14在生理條件下低表達，但在應(yīng)激或者組織損傷時表達增加，輕度激活可促進組織再生和修復，過度及持續(xù)激活則會引起一系列炎癥反應(yīng)。TWEAK和受體Fn14結(jié)合后能誘導角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、微血管內(nèi)皮細胞等增殖、遷移和血管形成，并分泌IL-6、IL-8、調(diào)節(jié)正常T細胞表達和分泌的活性因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)等促炎因子[4]。本課題組前期研究提出Fn14-TRAF2-TNFR信號軸觀點：特定炎癥微環(huán)境改變細胞的TNFR(腫瘤壞死因子受體)表達譜，免疫細胞分泌的TWEAK與細胞跨膜Fn14結(jié)合，通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(TNF receptor associated factor 2,TRAF2)將信號傳導至TNFR亞型分子，繼而調(diào)控細胞凋亡(TNFR1高表達)或增殖(TNFR2高表達)[5-6]。迄今為止，TWEAK/Fn14信號在結(jié)節(jié)性紅斑中的表達尚無文獻報道，因此本研究主要檢測TWEAK/Fn14在結(jié)節(jié)性紅斑患者組織中的表達水平，研究其在結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病過程中的作用，并為其相關(guān)藥物治療提供方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年6月-2021年10月就診于西安交通大學第二附屬醫(yī)院并于皮膚科完善皮膚活檢的結(jié)節(jié)性紅斑患者，其中男5例，女10例，年齡23～50歲。正常對照組來自皮膚科色素痣切除術(shù)的患者。入選標準：經(jīng)臨床及皮膚病理確診的結(jié)節(jié)性紅斑患者，即臨床表現(xiàn)為下肢對稱分布、伴有觸痛的紅色皮下結(jié)節(jié)或紅斑，同時病理表現(xiàn)為小葉間隔受累為主的脂膜炎患者，且患者無其他皮膚病及全身系統(tǒng)性疾病。

1.2主要試劑與儀器 兔抗人Fn14多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國CST公司)，兔抗人TWEAK多克隆抗體(美國Abcam公司)，Trizol(invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green(Takara)；PCR引物(上海生工生物工程公司)；實時熒光定量PCR儀(ABI)；蛋白垂直電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(德國BIO-RAD公司)。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR 取上述皮損組織和正常組織采用Trizol進行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄后獲得模板cDNA，實時熒光定量PCR檢測組織中TWEAK、Fn14基因表達水平，TWEAK正向引物序列為5′-AGGTGTGGACGGGACAGTGAG-3′，反向引物序列為5′-CCAGCACACCATCCACCAG-3′，F(xiàn)n14正向引物序列為5′-CTCTGAGCCTGACCTTCGTG-3′，反向引物序列為5′-GGGGGCACATTGTCACTGGA-3′，GAPDH正向引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。引物合成于上海生工生物工程公司。

1.3.2蛋白印跡 RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA定量法測定蛋白濃度，加入5×loading buffer制定蛋白樣品，95 ℃變性5 min，蛋白樣品等質(zhì)量等體積上樣后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入TWEAK、Fn14、β-actin抗體4 ℃孵育過夜，洗膜后加入對應(yīng)種屬的二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜4次，ECL化學發(fā)光系統(tǒng)成像并進行灰度值統(tǒng)計。

1.3.3免疫組織化學染色 將切好的石蠟組織載玻片于62 ℃烘烤30～40 min，常規(guī)脫蠟、水化，抗原修復10 min后自然冷卻至室溫，PBS浸洗，組織表面滴加3%內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS浸洗5 min，2%BSA封閉，37 ℃孵育30 min，滴加適當比例的一抗，4 ℃濕盒過夜。次日滴加DAKO二抗，DAB顯色，蘇木素復染，PBS返藍，干燥后中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK和Fn14分子mRNA表達差異比較 通過實時熒光定量PCR檢測在結(jié)節(jié)性紅斑患者和正常人皮膚組織中TWEAK/Fn14分子的表達水平，結(jié)果顯示，皮損組織中TWEAK mRNA表達顯著高于正常皮膚組織，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.07，P<0.01)，F(xiàn)n14在皮損組織中有上升趨勢(t=0.34，P=0.74)，見圖1。

Note: **P<0.01 vs. control group.圖1 TWEAK/Fn14分子在皮膚組織中的mRNA表達水平Fig.1 The mRNA expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue

2.2皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK和Fn14蛋白表達水平 蛋白印跡結(jié)果顯示，結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損組織中TWEAK和Fn14蛋白表達水平升高，而正常皮膚組織中表達較低，統(tǒng)計結(jié)果用灰度值表示，差異均有統(tǒng)計學意義(TWEAK：t=3.68，P<0.01；Fn14：t=7.67，P<0.000 1)，見圖2。

Note: **P<0.01 vs. control group；****P<0.000 1 vs. control group.圖2a～2c TWEAK/Fn14蛋白在皮膚組織中的蛋白表達水平Fig.2a～2c The protein expression levels of both TWEAK and Fn14 in skin tissue

2.3免疫組織化學檢測TWEAK和Fn14蛋白表達水平 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，TWEAK和Fn14蛋白主要在真皮層血管周圍及脂肪小葉間隔表達，主要定位在細胞膜，為棕色顆粒沉積；表皮層有少量表達。正常組織有少量陽性細胞著色，呈淺棕色，著色程度明顯少于皮損組。TWEAK與Fn14均在結(jié)節(jié)性紅斑患者中表達高于正常皮膚組織。采用Image J統(tǒng)計軟件對陽性細胞面積進行統(tǒng)計學分析，差異有統(tǒng)計學意義(TWEAK：t=4.43，P<0.01；Fn14：t=3.83，P<0.01)，見圖3。

3 討論

結(jié)節(jié)性紅斑是皮膚中最常見的脂膜炎類型，其發(fā)病誘因較多，潛在因素復雜，發(fā)病機制仍不清楚，目前一般認為結(jié)節(jié)性紅斑可能是機體的一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，也可能是免疫復合物沉積在相應(yīng)部位所致[1]。臨床上主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、病史、實驗室檢查及組織病理進行綜合診斷，有學者認為免疫功能紊亂是其發(fā)病的主要原因[7]。

早期結(jié)節(jié)性紅斑患者伴有血管損傷、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，炎癥反應(yīng)會擴散到真皮和小葉脂膜，晚期還伴有淋巴細胞和巨噬細胞浸潤[8]。TWEAK是結(jié)構(gòu)高度保守的Ⅱ型跨膜蛋白，分為可溶性TWEAK和膜結(jié)合性TWEAK，其唯一受體Fn14胞外區(qū)有一富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域可與TWEAK結(jié)合，胞質(zhì)尾部含有TRAF結(jié)合位點。TWEAK主要通過分泌多種促炎因子、黏附分子和趨化因子，如RANTES、γ-干擾素誘導蛋白10(interferon gamma-induced protein 10, IP-10)和單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)，進而趨化巨噬細胞、淋巴細胞等炎癥細胞參與局部炎癥反應(yīng)[9-11]。在生理條件下TWEAK與Fn14的表達較低，組織損傷后其表達明顯上調(diào)[12]。課題組前期研究證明，在狼瘡性腎炎患者中，尿和血清中可溶性TWEAK水平升高與患者腎臟疾病活動相關(guān)。靶向TWEAK或其他抑制TWEAK/Fn14信號的中和抗體可減輕狼瘡小鼠模型的腎臟損害程度[9]；TWEAK/Fn14信號也參與銀屑病的發(fā)展，F(xiàn)n14缺失可改善銀屑病樣病變，并伴隨病變皮膚炎癥細胞浸潤和促炎細胞因子產(chǎn)生減少[13-14]。此外，研究[15]表明，TWEAK/Fn14信號通路在過敏性紫癜的發(fā)病機制中也起著重要作用。TWEAK血清水平在急性期過敏性紫癜患者中升高，且與疾病的嚴重程度相關(guān)。然而，關(guān)于TWEAK/Fn14信號軸在結(jié)節(jié)性紅斑中的表達尚無文獻報道。本研究采用實時熒光定量PCR、蛋白印跡以及免疫組織化學的方法，檢測皮損組織中TWEAK/Fn14 mRNA水平和蛋白水平變化。結(jié)果表明，與正常皮膚組織相比，結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損處TWEAK和受體Fn14顯著高表達，主要在真皮層血管周圍及脂肪小葉間隔。以往研究報道TWEAK/Fn14信號調(diào)控銀屑病皮損中真皮微血管內(nèi)皮細胞中炎癥因子和趨化因子的表達，微血管內(nèi)皮細胞通過表達黏附分子在白細胞募集中發(fā)揮重要作用。TWEAK/Fn14信號能刺激內(nèi)皮細胞中趨化因子如CCL5及炎癥相關(guān)黏附分子，如E-選擇素、細胞間黏附分子Ⅰ和血管內(nèi)皮生長因子-1的表達，促進血管增生，趨化白細胞、巨噬細胞等遷移至炎癥部位，從而加劇炎癥反應(yīng)[4]。因此，推測TWEAK/Fn14信號通路的激活與真皮血管中趨化因子、炎癥因子和黏附分子的募集分泌密切相關(guān)。

綜上所述，本研究通過比較結(jié)節(jié)性紅斑患者皮損組織及正常皮膚組織中TWEAK與Fn14的表達差異，提示TWEAK/Fn14通路可能在結(jié)節(jié)性紅斑發(fā)病機制中起重要作用。后續(xù)本課題組會繼續(xù)測定TWEAK/Fn14信號軸下游一系列趨化因子和炎癥因子，擴大樣本例數(shù)，進一步研究其調(diào)控機制，為結(jié)節(jié)性紅斑的臨床治療提供新思路。