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    IL-1β通過(guò)調(diào)節(jié)Stathmin/FAK通路促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的作用及機(jī)制

    2023-03-23 06:53:48何詠?lái)?/span>李凌霏岑蕊言鄧雨萌楊桂紅雷霞
    關(guān)鍵詞:真皮劃痕纖維細(xì)胞

    何詠?lái)?,李凌霏,岑蕊言,鄧雨萌,楊桂紅,雷霞

    成纖維細(xì)胞(fibroblast)是一類(lèi)具有收縮功能的肌纖維母細(xì)胞表型的細(xì)胞,當(dāng)皮膚創(chuàng)面形成后,炎癥啟動(dòng)并加速成纖維細(xì)胞遷移,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[1-2],但具體機(jī)制仍不十分清楚。Stathmin是一種微管解聚蛋白,參與微管動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn),其表達(dá)水平與皮膚成纖維細(xì)胞增殖和遷移密切相關(guān),提示Stathmin在調(diào)控皮膚創(chuàng)面愈合中具有重要作用,但其機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一種非受體酪氨酸激酶,在參與調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和增殖等過(guò)程中起關(guān)鍵作用[4],既往研究[5-6]表明,炎癥可以促進(jìn)FAK活化并促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。但FAK是否參與調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)下皮膚成纖維細(xì)胞遷移以及該過(guò)程是否與Stathmin有關(guān)均不清楚。因此,本研究擬闡明IL-1β通過(guò)調(diào)節(jié)Stathmin/FAK通路介導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的作用和初步機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1材料 人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast,HDF)購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自上海VivaCell公司;PBS緩沖液干粉購(gòu)自索萊寶(Solarbio)公司;鏈霉素-青霉素雙抗、0.25%胰酶(含EDTA)、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、電轉(zhuǎn)液購(gòu)自碧云天公司;細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京鼎國(guó)公司;人IL-1β重組蛋白購(gòu)自Sino Biological公司;FAK、Stathmin抗體購(gòu)自Proteintech公司;GAPDH、Anti-rabbit IgG HRP-linked抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST)公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、TBST購(gòu)自上海生工公司;電泳緩沖液粉劑購(gòu)自塞維爾公司;PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自碩華公司;小干擾RNA購(gòu)自吉瑪基因公司。

    1.2方法

    1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和模擬體外炎癥 配制加入雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基用于培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞。放入37 ℃、5%CO2含量的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,待細(xì)胞融合至80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代,選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。利用不同濃度的IL-1β體外刺激細(xì)胞,篩選適合的濃度(10 ng/mL)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) IL-1β重組蛋白10 ng/mL處理細(xì)胞24 h,小干擾RNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。待細(xì)胞在3.5 cm的培養(yǎng)皿中融合至80%左右,使用1 mL槍頭在培養(yǎng)皿中進(jìn)行劃痕,然后用PBS緩沖液清洗3遍輕柔沖掉細(xì)胞碎片。采用倒置光學(xué)顯微鏡(IX73,Olympus)拍照記錄。使用創(chuàng)面愈合率反映細(xì)胞遷移,創(chuàng)面愈合率=(劃痕面積0 h-劃痕面積24 h)/劃痕面積0 h,應(yīng)用Image J軟件對(duì)其進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.3Western blot檢測(cè) 人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,IL-1β重組蛋白10 ng/mL處理細(xì)胞24 h,小干擾RNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用RIPA裂解液在冰上裂解處理好的細(xì)胞,在4 ℃條件下以21 400×g離心15 min,吸取上清液。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行蛋白定量分析。蛋白樣品通過(guò)8%~12.5% SDS-PAGE加載和分離,然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后封閉1 h,將膜與特異性一抗(FAK、Stathmin、GAPDH)在4 ℃條件下孵育過(guò)夜。TBST清洗3遍,室溫下二抗孵育1 h,TBST再洗3遍,最后使用ChemiDoc XRS系統(tǒng)(ChemiDoc, Bio-Rad Laboratories)曝光顯影,用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4小干擾RNA轉(zhuǎn)染 用Stathmin小干擾RNA(siSTMN)和FAK小干擾RNA(siFAK)轉(zhuǎn)染細(xì)胞(siNC作為對(duì)照),按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。siNC、siSTMN或siFAK分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h,然后IL-1β(10 ng/mL)處理24 h,進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1IL-1β對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的影響 當(dāng)加入IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,細(xì)胞遷移較對(duì)照組明顯增加(t=3.868,P<0.05),而加入IL-1β(500 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,細(xì)胞遷移較對(duì)照組明顯抑制(t=7.329,P<0.05),見(jiàn)圖1。

    Note:*P<0.05,**P<0.01. The migration of human dermal fibroblasts before and after treatment with IL-1β(10 ng/mL)、IL-1β(500 ng/mL)was observed by cell scratch assay; Quantitative analysis of scratch assay圖1 IL-1β處理前后對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的影響Fig.1 Effects of IL-1β on migration of human dermal fibroblasts

    2.2Stathmin蛋白表達(dá)在IL-1β調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用 Western blot檢測(cè)人真皮成纖維細(xì)胞Stathmin蛋白表達(dá)情況(圖2),結(jié)果顯示:IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,Stathmin蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(t=7.131,P<0.05)。

    Note:**P<0.01. The expression of Stathmin protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/mL) treatment was detected by Western blot; Quantitative analysis of Western blot圖2 IL-1β處理前后對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞Stathmin蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of IL-1β on Stathmin protein expression in human dermal fibroblasts

    細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞遷移(圖3),結(jié)果顯示:IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,人真皮成纖維細(xì)胞遷移較對(duì)照組明顯增加(t=8.537,P<0.05),當(dāng)使用siSTMN干擾Stathmin表達(dá)后,siSTMN組和IL-1β+siSTMN組細(xì)胞遷移均明顯減弱(t=5.086、7.240,P<0.05)。

    The effect of IL-1β(10 ng/mL) on the migration of human dermal fibroblasts before and after siSTMN treatment was observed by cell scratch assay; Quantitative analysis of scratch assay圖3 Stathmin蛋白表達(dá)在IL-1β調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用Fig.3 Effects of Stathmin protein expression on IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

    2.3FAK蛋白表達(dá)在IL-1β調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用 Western blot檢測(cè)人真皮成纖維細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)情況(圖4),結(jié)果顯示:IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,F(xiàn)AK蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(t=5.308,P<0.05)。

    Note:**P<0.01. The expression of FAK protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/mL) treatment was detected by Western blot; Quantitative analysis of Western blot圖4 IL-1β處理前后對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞FAK蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of IL-1β on FAK protein expression in human dermal fibroblasts

    細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察細(xì)胞遷移(圖5),結(jié)果顯示:IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,人真皮成纖維細(xì)胞遷移較對(duì)照組明顯增加(t=6.589,P<0.05),當(dāng)使用siFAK干擾FAK表達(dá)后,siFAK組和IL-1β+siFAK組細(xì)胞遷移均明顯減弱(t=4.487、8.071,P<0.05)。

    The effect of IL-1β(10 ng/mL) on the migration of human dermal fibroblasts before and after siFAK treatment was observed by cell scratch assay; Quantitative analysis of scratch assay圖5 FAK蛋白表達(dá)在IL-1β調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用Fig.5 Effects of FAK protein expression on IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

    2.4IL-1β通過(guò)Stathmin調(diào)控FAK介導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞遷移的作用機(jī)制 Western blot檢測(cè)人真皮成纖維細(xì)胞FAK、Stathmin蛋白表達(dá)情況(圖6),結(jié)果提示:IL-1β(10 ng/mL)處理細(xì)胞24 h后,F(xiàn)AK和Stathmin蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增加(t=6.199、20.88,P<0.05),當(dāng)使用siSTMN干擾Stathmin表達(dá)后,siSTMN組和IL-1β+siSTMN組中FAK和Stathmin蛋白表達(dá)均明顯減少(t=4.946、6.175、10.39、32.86,P<0.05)。

    Note :**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1, ns indicated no significant difference. The expression of FAK and Stathmin protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/ mL) treatment was detected by Western blot; ~ Quantitative analysis of Western blot圖6 Stathmin/FAK通路在IL-1β調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用Fig.6 Effects of Stathmin/FAK pathway in the regulation of IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

    3 討論

    皮膚是人體面積最大的器官,在保護(hù)人體內(nèi)部組織免受機(jī)械損傷、微生物感染、紫外線(xiàn)輻射和極端溫度影響等方面起到關(guān)鍵作用[7]。皮膚作為身體免受外部環(huán)境影響的重要保護(hù)屏障,經(jīng)常暴露或損傷于潛在的傷害中,當(dāng)皮膚受損后,皮膚組織中的多種細(xì)胞會(huì)相互協(xié)調(diào)、發(fā)揮各自的作用以實(shí)現(xiàn)修復(fù)愈合。因此,創(chuàng)面修復(fù)已成為所有高等生物生存具備的重要生理過(guò)程[8]。創(chuàng)面愈合最主要的目標(biāo)是修復(fù)受損屏障,恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)和功能完整性,從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程大致可以分為三個(gè)階段:炎癥階段、增殖階段和組織重塑階段[9]。創(chuàng)面愈合的早期炎癥階段通常需要72 h才能完成,接下來(lái)的增殖期則以大量細(xì)胞和結(jié)締組織的積累為特征,此階段將維持?jǐn)?shù)天至數(shù)周不等[10]。本文所提到的成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)的整個(gè)過(guò)程中都起著重要的作用,既往本課題組研究[11]發(fā)現(xiàn),早期適度炎癥能夠通過(guò)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移從而加速創(chuàng)面的愈合。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是白細(xì)胞介素-1(IL-1)家族中的一員,是機(jī)體重要的炎癥反應(yīng)介質(zhì);當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)或發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí),IL-1β可參與細(xì)胞增殖、分化和遷移等多種細(xì)胞活動(dòng),此外,他還可以通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞、動(dòng)員中性粒細(xì)胞以及激活各類(lèi)其他白細(xì)胞等方式,引發(fā)急性炎癥[12]。本研究發(fā)現(xiàn),使用低濃度IL-1β處理人真皮成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞遷移明顯增加,而高濃度IL-1β則會(huì)抑制細(xì)胞遷移,提示在創(chuàng)面修復(fù)早期給予適度的炎癥刺激可以加速創(chuàng)面的愈合,盡管該觀(guān)點(diǎn)被證明并接受,但其中潛在的機(jī)制仍未完全闡明。

    眾所周知,微管參與許多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,例如細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞遷移等[13]。Stathmin作為調(diào)節(jié)微管動(dòng)力學(xué)的重要蛋白,廣泛表達(dá)于多種組織細(xì)胞,以往對(duì)于Stathmin的研究大都與腫瘤相關(guān)。研究[14-16]發(fā)現(xiàn),Stathmin的表達(dá)水平與多種腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),并認(rèn)為其可能是腫瘤進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物,與腫瘤的分化和患者的預(yù)后都息息相關(guān)。但是Stathmin在腫瘤以外的組織細(xì)胞(例如皮膚組織)中的作用及相關(guān)研究報(bào)道較少。本課題組通過(guò)前期研究[3]發(fā)現(xiàn),LPS、TNF-α等細(xì)胞因子刺激后,人真皮成纖維細(xì)胞Stathmin蛋白表達(dá)增加,通過(guò)誘導(dǎo)微管解聚或偽足增加,從而促進(jìn)細(xì)胞遷移,然而其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步探索Stathmin在人真皮成纖維細(xì)胞遷移中的作用機(jī)制,筆者在本研究中進(jìn)一步利用合適濃度的IL-1β模擬體外早期炎癥反應(yīng),探索潛在的分子機(jī)制,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),IL-1β可以加速人真皮成纖維細(xì)胞遷移,而經(jīng)Stathmin小干擾RNA干擾Stathmin蛋白表達(dá)后,成纖維細(xì)胞遷移顯著下降,這與筆者前期的報(bào)道結(jié)論相一致,但其中機(jī)制仍然不清。

    既往研究[17]揭示,F(xiàn)AK是一種非受體酪氨酸激酶,是胞內(nèi)多種信號(hào)傳導(dǎo)的交通樞紐,在生長(zhǎng)發(fā)育、黏附、遷移、增殖等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中都起著重要的作用。不僅如此,有相關(guān)研究[18]發(fā)現(xiàn),在食管鱗癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Stathmin可以顯著上調(diào)FAK蛋白表達(dá),提示Stathmin/FAK通路可能參與了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。但是Stathmin/FAK通路是否參與皮膚創(chuàng)面愈合卻并不清楚。因此,結(jié)合課題組前期發(fā)現(xiàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,筆者證明,IL-1β處理后的人真皮成纖維細(xì)胞Stathmin和FAK蛋白表達(dá)都顯著增加,而干擾Stathmin或FAK表達(dá)后,細(xì)胞遷移均受抑,提示IL-1β可能通過(guò)調(diào)節(jié)Stathmin和FAK從而促進(jìn)細(xì)胞遷移。不僅如此,當(dāng)下調(diào)Stathmin表達(dá)后,F(xiàn)AK表達(dá)也會(huì)隨之減少,并且細(xì)胞遷移受抑。進(jìn)一步提示,Stathmin可能通過(guò)調(diào)控FAK繼而參與IL-1β誘導(dǎo)的真皮成纖維細(xì)胞遷移。

    綜上所述,IL-1β刺激可以加速人真皮成纖維細(xì)胞遷移,繼而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Stathmin/FAK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn),這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步揭示了創(chuàng)面愈合新機(jī)制并有望為臨床干預(yù)早期創(chuàng)面愈合提供新靶點(diǎn)和新方向。

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