基于生物信息學探討ALPL基因在多囊卵巢綜合征中的表達及其臨床價值*

付彥博，王 雯，許寶丹，彭蕓花

(1.海南醫(yī)學院第二臨床學院，?？?570216; 2.海南省婦女兒童醫(yī)學中心，?？?570312；3.海南醫(yī)學院，海口 571199)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是女性最常見的生殖內分泌及代謝紊亂性疾病，也是生育期女性不孕不育的主要原因，近年其全球患病率呈明顯上升趨勢[1]。PCOS病因不明，發(fā)病機制復雜多樣，臨床癥狀高度異質，尚無明確有效的防治手段，尋找高效靶分子仍是研究熱點。堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALPL)又稱TNAP、TNALP、APTNAP、TNSALP、AP-TNAP、TNS-ALP，位于1號染色體短臂，參與多種腫瘤的發(fā)生和進展，在PCOS中未見研究[2]。本研究利用生物信息技術有效整合多種數據集，圍繞PCOS和ALPL進行深度挖掘，并應用臨床標本進行驗證，初探ALPL在PCOS發(fā)生中的作用及其關鍵基因，為PCOS的靶向研究提供新的研究思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料收集 選擇2021年11月3日至2022年1月1日在海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心就診的女性患者21例，其中PCOS 11例和非PCOS 10例，符合2003年鹿特丹PCOS國際診斷標準，排除因其他原因導致的排卵異常或高雄激素以及無嚴重心、肺、肝等重癥疾病。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(HYLL-2021-127)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 數據集獲取及篩選差異 通過NCBI的基因表達綜合數據庫(GENE EXPRESSION OMNIBUS,GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)搜集并獲取本研究所需的PCOS微陣列相關數據集GSE106724的原始數據，其中GSE106724包括8例PCOS患者及4例非PCOS患者，進行mRNAs的微陣列篩選。此數據集系列矩陣文件和平臺作為CEL文件下載。數據集的差異分析，使用GEO2R在線分析工具進行分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)，以adj-P<0.05與| logFC|>1為標準，篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)。

1.2.2 PPI網絡構建與分析 將差異基因DEGs上傳至STRING數據庫(https://string-db.org/)，獲得交集靶標的PPI網絡圖和相關數據。將相關數據通過Cytoscape 3.9.0構建網絡圖。

1.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析 利用R4.0.5軟件對DEGs的交集靶點進行基因功能分析(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，并將結果根據GeneRatio大小排序。此外，利用“pathview”包繪制GeneRatio值最大的信號通路圖。

1.2.4 RNA提取及QRT-PCR對卵泡液中顆粒細胞進行檢測 卵泡液經200目細胞篩過篩，使用RNA提取試劑盒(普洛麥格，上海)提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒(翊圣生物，上海)進行逆轉錄為cDNA。所有操作按試劑盒使用說明進行。使用q225熒光定量PCR儀檢測基因表達，反應條件按熒光定量 PCR 試劑盒(翊圣生物，上海)操作說明進行。數據分析采用2-ΔΔCt法。各基因及其內參的擴增引物序列見表1。

表1 RT-qPCR中使用的引物序列

2 結 果

2.1 PCOS相關差異基因篩選 從GEO數據庫中下載 GSE106724 ，去除一個探針對應多個分子的探針，遇到對應同一個分子的探針時，僅保留信號值最大的探針。GSE106724包括8例PCOS患者 (PCOS ) 和4例正常(Normal)進行mRNAs的微陣列篩選，對所有數據進行標準化，并用GEO2R中基于R的Web應用進行分析，且各個樣本中位數基本在一個水平線，表明樣本間歸一化程度好(圖1)。使用GEO2R在線工具對GSE106724數據集進行差異表達分析，根據納入標準確定DEGs，adj-P<0.05,|logFC|>1進行篩選，使用R語言 (版本3.5.1) 的ggplot2和venndiam包，通過火山圖繪制DEGs可視化。結果顯示，PCOS數據集GSE106724中共獲得607個差異表達基因，上調310個，下調297個(圖2)。

2.2 構建PPI網絡 通過STRING數據庫和Cytoscape軟件對607個DEGs進行網絡關系圖分析，生成PPI網絡，網絡中的節(jié)點表示蛋白質，連線表示蛋白質之間的相互作用(圖3)。

2.3 對DEGs進行GO、KEGG富集分析 GO功能富集分析包括：細胞對干擾素的反應(cellular response to interferon-gamma)、趨化因子受體結合(CCR chemokine receptor binding)、干擾素代謝信號通路(interferon-gamma-mediated signaling pathway)；MHC Ⅱ類蛋白復合體(MHC class Ⅱ protein complex)、內質網膜腔側的組成部分(integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)等，這些生物學過程均與離子轉運和膜蛋白運輸等有關(表2及圖4、5)。KEGG富集分析結果顯示，這些差異基因主要參與了以下信號通路的調節(jié)：哮喘(Asthma)、類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、同種異體移植排斥(Allograft rejection)、I型糖尿病(Type I diabetes mellitus)等(圖6)。

表2 GO功能富集具體信息

通過對607個DEGs進行整合分析發(fā)現，ALPL蛋白在蛋白-蛋白相互作用網絡中,與SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5蛋白之間存在相互作用，表明ALPL、SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5關聯性較強。因此，通過對圍繞ALPL的差異基因進行PPI蛋白互作具體描述(圖7、表3)。

2.4 對關鍵基因進行臨床驗證 qRT-PCR法對PCOS和非PCOS患者顆粒細胞中關鍵基因的mRNA進行檢測，結果發(fā)現ALPL mRNA含量在PCOS患者卵泡液中均低于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)，SPP1、FKBP5、AKAP5 mRNA含量在PCOS患者卵泡液中均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)，結果與前期綜合得到的數據和趨勢相一致，DLX5、LDHAL6A無統計學意義(圖8)。

3 討 論

PCOS是一種常見內分泌疾病，影響約5%～15%的育齡婦女，是生育期女性不孕不育的主要原因，高血壓、早期動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝、抑郁/焦慮等情感障礙性疾病的發(fā)病風險增高，遠期糖尿病、心血管疾病、子宮內膜癌等發(fā)病率明顯增加，嚴重影響女性身心健康及家庭幸福[4-5]。隨著各種大規(guī)模非腫瘤生物學數據的產生，生物信息學的研究方法與策略開始深入到各種疾病研究的各個層面,并取得了很多振奮人心的科研成果[6]。本研究中，整合GSE106724數據集，分析了12個樣品，其中包括4例正常人卵泡液，8例PCOS患者卵泡液，篩選出與PCOS相關聯的607個差異基因，其中310個DEGs表達上調，297個DEGs表達下調。通過對這些DEGs的GO富集分析表明，DEGs主要介入細胞對干擾素的反應(cellular response to interferon-gamma)、趨化因子受體結合(CCR chemokine receptor binding)、干擾素代謝信號通路(interferon-gamma-mediated signaling pathway)；MHC Ⅱ類蛋白復合體(MHC class Ⅱ protein complex)、內質網膜腔側的組成部分(integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)等生物學過程，而這些生物學過程均與離子轉運和膜蛋白運輸等有關。本研究KEGG通路分析發(fā)現，這些DEGs主要富集于：哮喘(Asthma)、類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis)、同種異體移植排斥(Allograft rejection)、Ⅰ型糖尿病(Type I diabetes mellitus)等。應用STRING數據庫和cytoscape軟件估計DEGs之間的相關性，發(fā)現以ALPL為中心與SPP1、FKBP5、AKAP5、LDHAL6A、DLX5互作性較強。通過對臨床樣品RT-qPCR實驗驗證，ALPL在PCOS組的表達低于非PCOS組，SPP1、FKBP5、AKAP5 3個基因在PCOS組的表達均高于非PCOS組(P<0.05)，與前期數據和趨勢一致。綜上表明這4個基因在PCOS中的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。其中ALPL在這幾個基因中處于中心位置，將其相互關聯。

研究表明，非特異性堿性磷酸酶ALPL 基因突變可導致堿性磷酸酶活性偏低，從而引起低堿性磷酸酶酯血癥，其主要臨床表現有佝僂病、肌肉張力減退、癲癇和多發(fā)性骨折等[7]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腦膜瘤中ALPL部分片段表達缺失，因此 ALPL 被認為是腦膜瘤候選抑癌基因[8]。在前列腺癌中，ALPL 表達增高與更差的生存預后相關[9]。據文獻報道，雄激素過多則導致PCOS發(fā)生[10]，高雄激素則是PCOS的主要特征，因此ALPL可能會作為PCOS的表型指標之一。

分泌磷蛋白1 (secreted phosphoprotein 1,SPP1)，又稱骨橋蛋白樣蛋白或早期蛋白T淋巴細胞活化蛋白1，是一種多功能分泌性酸性糖蛋白[11]。SPP1屬于小整合素結合配體n -連接糖蛋白家族，主要表現在骨骼和牙齒上。研究發(fā)現，ALPL基因敲除小鼠表現為牙骨質缺失，SPP1基因表達異常[12]。SPP1與乳腺癌惡性程度呈正相關[13]。最近一項研究表明，SPP1在肺癌中高表達，其表達量與腫瘤有關分期、淋巴結浸潤、腫瘤生長密切相關[14]。FK506(FK506 binding proteins,FKBPs)是高度保守的伴侶分子蛋白家族，通過激活組蛋白分子伴侶、調控轉錄因子及改變染色質結構，影響基因表達、修復及復制等，其中結合蛋白5(FKBP5)是其家族成員之一。研究顯示，FKBP5與某些實體瘤的發(fā)生有關，其高表達可誘導正常細胞轉化為腫瘤干細胞[15]。在人類腫瘤研究中，FKBP5表達升高或降低均有發(fā)現[16]。目前越來越多研究顯示，FKBP5可能是腫瘤的新型靶向指標[17]。此外，目前發(fā)現AKAPs (A-kinase anchoring protein)是一種結構不同但具有相似功能的蛋白家族，可調控心臟中鈣離子的變化、心肌肥大、心力衰竭等[18]。AKAP5，也可稱為AKAP79/AKAP150,被證明可與蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)結合調控下游蛋白變化，還包括多種關鍵蛋白，PKC和鈣調蛋白(calmodulin,CaM)等信號分子錨定結合形成復合物，調控心肌細胞的各種活動[19]。AKAP5在心律失常疾病中可調控鈣離子超載，影響心房心室的信號傳導，加重心律失常，是鉀離子通道突變引起心律失常的潛在治療靶點[20]。

綜上所述，ALPL、SPP1、FKBP5、AKAP5參與多種腫瘤的發(fā)生，本研究通過生物信息技術預測發(fā)現，它們也參與PCOS的發(fā)生發(fā)展，卵泡液中mRNA檢測也驗證了這一結果，其中ALPL位于它們作用的核心部位，可能是PCOS發(fā)生的限速基因，通過調控SPP1、FKBP5、AKAP5介導的信號通路促進PCOS的發(fā)生發(fā)展，有望成為PCOS新的靶分子。本研究只是初步發(fā)現，具體作用及機制需進一步研究。