SIRT3在早發(fā)型子癇前期胎盤組織中的表達(dá)及作用*

朱盛蘭，都園淵，王少帥，張慧婷，江 一，張婧怡，周 璇，馮 玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430000)

子癇前期(preeclampsia，PE)作為一種妊娠期嚴(yán)重并發(fā)癥，影響著全球3%～12%的孕產(chǎn)婦，是孕產(chǎn)婦死亡的主要原因之一[1]。妊娠34周前發(fā)病稱為早發(fā)型子癇前期(early-onset preeclampsia，eoPE)，其病情進(jìn)展快、癥狀較重且預(yù)后較差，常伴隨胎兒生長受限，成為大多數(shù)PE研究的焦點(diǎn)。PE發(fā)病機(jī)制是多因素、多機(jī)制及多通路的，但具體機(jī)制仍不清。普遍認(rèn)為，eoPE是一種“胎盤源性疾病”[2]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(silence information regulator 3，SIRT3)屬于Sirtuins家族，廣泛表達(dá)于肝臟、心臟及腎臟等富含線粒體、新陳代謝快的器官[3]。SIRT3具有廣泛且重要的生物學(xué)活性，通過去乙?；磻?yīng)，參與細(xì)胞增殖和凋亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞周期、細(xì)胞自噬等過程，調(diào)控神經(jīng)和心血管疾病等[4]。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3在孕晚期胎盤組織中的表達(dá)水平低于孕早、中期，且SIRT3在PE患者胎盤中表達(dá)降低，但其在胎盤源性疾病，如eoPE中的作用尚不清楚[5-7]。本研究通過檢測(cè)eoPE患者胎盤組織中SIRT3表達(dá)，以妊娠早期絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo為研究對(duì)象，探索SIRT3對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控及其機(jī)制，以期揭示SIRT3在eoPE發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 選取2019年3月至2019年12月在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院住院分娩的早發(fā)型PE患者10例(eoPE組)，同期選取年齡和孕周相匹配的10例非感染性早產(chǎn)患者作為對(duì)照組(NC組)。eoPE診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版[8]。兩組孕婦均為單胎、剖宮產(chǎn)分娩。排除標(biāo)準(zhǔn)：多胎、生殖器官畸形、先天性遺傳性疾病以及其他妊娠相關(guān)合并癥(如高血壓、糖尿病、甲狀腺疾病史等)；前置胎盤、胎盤早剝、羊水量異常。eoPE組和NC組的年齡、孕周、孕次和產(chǎn)次比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 患者基本資料

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和處理 胎盤娩出后，避開梗死及鈣化等組織部位，迅速以臍帶插入點(diǎn)為中心分四個(gè)象限，于母體面四個(gè)象限各取1.0cm×1.0cm×1.0cm大胎盤組織，冰浴無菌PBS充分漂洗，無菌紗布吸干水分。一部分分裝后-80℃凍存用于提取RNA和蛋白；一部分多聚甲醛固定，梯度酒精脫水后石蠟包埋并切片，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫組化 組織蠟塊連續(xù)切片，65℃常規(guī)烘片、二甲苯脫蠟及梯度酒精水化，3%過氧化氫室溫孵育，檸檬酸修復(fù)液高溫抗原修復(fù)。其余嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行(武漢Servicebio公司)。一抗為兔抗人SIRT3單克隆抗體(1∶100稀釋，英國Abcam公司)，PBS為陰性對(duì)照。顯微鏡下觀察并取不同視野拍照，利用Image pro plus軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析，得到平均光密度值(Mean Density)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HTR-8/SVneo細(xì)胞購自ATCC，復(fù)蘇后用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，加1%青鏈霉素(武漢Servicebio公司)，置5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，將細(xì)胞按4×105/孔接種至六孔板。細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)，按NeofectTMDNA轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染(北京Neofect公司)。EMPTY組和SIRT3組分別轉(zhuǎn)染pCMV-MCS-3*Flag和pCMV-MCS-3*Flag-SIRT3(濟(jì)南維真生物)。轉(zhuǎn)染后48h，qRT-PCR和Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(南京Vazyme公司)。SIRT3引物序列：上游為5'-GCTCTACACGCAGAACATCG-3'，下游為5'-CATCACGTCAGCCCGAAT-3'；β-actin上游為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游為5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。采用2-△△CT相對(duì)定量法進(jìn)行分析。

1.2.5 Matrigel侵襲和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)：提前制備鋪好基質(zhì)膠(美國BD公司)的小室(Matrigel基質(zhì)膠：無血清培養(yǎng)基=1∶7)，下室加600μL含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，上室均勻滴加100μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸為2×105/mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h，取出小室(美國Corning公司)，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡拍照，Image J統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。劃痕實(shí)驗(yàn)：六孔板中的細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h，待細(xì)胞貼壁生長至80%時(shí)用相同型號(hào)的移液管進(jìn)行劃痕，PBS輕柔清洗去除細(xì)胞碎片，0h和24h在相同位置拍攝圖像，使用Image J分析。

1.2.6 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立 細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，按4×105細(xì)胞/孔接種至六孔板。細(xì)胞貼壁后，給予含不同濃度CoCl2(0、100、200、300和400μmol/L)的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)處理細(xì)胞24h。Western blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT3表達(dá)。

1.2.7 ROS檢測(cè) 使用ROS試劑盒(碧云天生物)測(cè)定六孔板細(xì)胞內(nèi)ROS水平，加2mL無血清1640培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA(1∶1000)，37℃避光孵育30min，PBS洗滌2次去除未進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的熒光探針，激光共聚焦顯微鏡觀察，取不同視野下拍照。

1.2.8 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 使用總SOD活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法)、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒、總谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定胎盤組織和細(xì)胞內(nèi)總SOD、MDA和總GSH的含量水平(碧云天生物)。所有步驟均按說明書進(jìn)行操作，通過酶標(biāo)儀設(shè)定特定波長(總SOD檢測(cè)波長：450nm；MDA檢測(cè)波長：532nm；總GSH檢測(cè)波長：340nm)檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算結(jié)果。

1.2.9 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液(含1% PMSF和磷酸酶抑制劑)提取胎盤組織和細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)量蛋白濃度(碧云天生物)。SDS-PAGE凝膠電泳，冰浴下300mA恒流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)。5% BSA封閉1h，4℃搖床孵育一抗過夜。一抗有SIRT3兔單抗(1∶1000，Abcam)；Akt(pan)兔單抗、Phospho-Akt(Thr308)兔單抗、PDK1兔多抗、Phospho-PDK1(Ser241)兔單抗、Phospho-GSK-3β(Ser9)兔單抗、Phospho-c-Raf(Ser259)兔單抗(1∶1000，CST)；β-actin鼠單抗(1∶10000，Abbkine)。次日TBST洗膜3次，室溫?fù)u床上孵育二抗1h，TBST洗膜3次后ECL發(fā)光法顯影曝光。Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組胎盤組織中SIRT3表達(dá)情況 免疫組化和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SIRT3在eoPE組胎盤組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖1 免疫組化法圖片(100×)

圖2 胎盤組織中SIRT3蛋白表達(dá)

2.2 兩組產(chǎn)婦胎盤組織氧化應(yīng)激因子水平 與對(duì)照組比較，eoPE組胎盤組織SOD和GSH-Px水平明顯降低，MDA水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 各組胎盤組織氧化應(yīng)激因子水平

2.3 過表達(dá)SIRT3對(duì)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲的影響 SIRT3組細(xì)胞SIRT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于EMPTY組細(xì)胞(P<0.001)，見圖4。通過劃痕實(shí)驗(yàn)與Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過表達(dá)SIRT3后HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。結(jié)果表明，與EMPTY組相比，SIRT3組 HTR-8/SVneo細(xì)胞的遷移和侵襲能力分別增加1.49倍和1.74倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 HTR-8/Svneo細(xì)胞過表達(dá)SIRT3表達(dá)效率驗(yàn)證

2.4 CoCl2對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞SIRT3表達(dá)的影響 加CoCl2處理HTR-8/SVneo細(xì)胞24h后，Western blot結(jié)果顯示，滋養(yǎng)細(xì)胞中SIRT3表達(dá)隨著CoCl2濃度增加逐漸下降，300μmol/L CoCl2處理24h的滋養(yǎng)細(xì)胞中SIRT3表達(dá)明顯減少(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)CoCl2處理24h后各組細(xì)胞中SIRT3表達(dá)水平*P<0.05 vs 0μmol/L CoCl2

2.5 CoCl2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激 HTR-8/SVneo細(xì)胞中加300μmol/L CoCl2處理24h。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，活性氧含量明顯增加，見圖6。檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)分子，發(fā)現(xiàn)CoCl2可明顯地降低滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)SOD活性(P<0.05)，提升MDA水平(P<0.05)，而對(duì)GSH-Px活性并無明顯影響(P>0.05)。見圖7。

圖6 激光共聚焦顯微鏡下觀察HTR-8/SVneo細(xì)胞中活性氧含量

圖7 CoCl2誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)分子變化

2.6 過表達(dá)SIRT3抑制滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激 向過表達(dá)SIRT3的滋養(yǎng)細(xì)胞及EMPTY組中分別加300μmol/L CoCl2處理24h。激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SIRT3可使HTR-8/SVneo細(xì)胞活性氧含量明顯減少，見圖8。過表達(dá)SIRT3明顯增強(qiáng)HTR-8/SVneo細(xì)胞中SOD和GSH-Px水平，且能減少M(fèi)DA生成(P<0.05)，見圖9。

圖8 激光共聚焦顯微鏡下觀察HTR-8/SVneo細(xì)胞中活性氧含量

圖9 過表達(dá)SIRT3顯著緩解了CoCl2誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)分子變化

2.7 SIRT3調(diào)節(jié)Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá) 與EMPTY組相比，上調(diào)HTR-8/SVneo細(xì)胞中SIRT3蛋白表達(dá)后，SIRT3組細(xì)胞Akt(pan)、p-Akt(Thr308)、p-GSK-3β(Ser9)、PDK1及p-c-Raf(Ser259)蛋白表達(dá)明顯增加，而p-PDK1(Ser241)蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)，見圖10。

圖10 Western blot法檢測(cè)Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討 論

目前PE的發(fā)病機(jī)制最為認(rèn)可的是“兩階段”學(xué)說[9]。以34孕周為界，可將PE分為早發(fā)型和晚發(fā)型PE兩種亞型。這兩種亞型在病因、臨床表現(xiàn)和預(yù)后上都存在著明顯差異。普遍認(rèn)為，早發(fā)型PE是一種胎盤源性疾??；而晚發(fā)型PE患者常伴有代謝異?；蛐难芗膊。啾徽J(rèn)為是為母源性疾病，因此二者需區(qū)分看待[2]。胎盤中線粒體含量豐富，負(fù)責(zé)補(bǔ)充胎盤組織所需ATP[10]。胎盤線粒體功能異?？稍斐蒖OS產(chǎn)生過多，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡增加，修飾脂肪酸氧化以及導(dǎo)致線粒體損傷。這些改變引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和影響子宮螺旋動(dòng)脈收縮，引起胎盤功能障礙，造成PE尤其是eoPE發(fā)生。

SIRT3主要位于線粒體基質(zhì)，可通過去乙?；揎椂喾N線粒體蛋白，影響線粒體形態(tài)與功能，參與調(diào)節(jié)能量代謝、ROS清除、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、侵襲及遷移等[11-12]。SIRT3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和間質(zhì)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞漿[5]。本研究Western blot結(jié)果顯示，eoPE患者胎盤組織中SIRT3蛋白表達(dá)明顯下降。eoPE組對(duì)應(yīng)的對(duì)照組原則上應(yīng)為年齡和孕周相匹配且無感染因素的早產(chǎn)孕婦，而這類孕婦早產(chǎn)的病因尚不清楚，臨床病例數(shù)也較少，這也致使此研究存在一定限制。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SIRT3對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，HTR-8/SVneo細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒上調(diào)SIRT3表達(dá)，結(jié)果表明過表達(dá)SIRT3促進(jìn)HTR-8/SVneo細(xì)胞遷移與侵襲。

氧化應(yīng)激被定義為活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的生成與細(xì)胞抗氧化能力間的不平衡[13]。健康孕婦血清中ROS含量較未妊娠時(shí)增加，這是由全身炎性反應(yīng)引起的正常生理現(xiàn)象，與胚胎發(fā)育及妊娠維持等相關(guān)[14]。ROS含量增加，打破抗氧化防御系統(tǒng)的代償平衡時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。研究表明，eoPE患者胎盤組織中總氧化水平升高和抗氧化能力減弱，eoPE患者體內(nèi)氧化應(yīng)激與免疫耐受和免疫調(diào)節(jié)異常也存在關(guān)聯(lián)[15]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，eoPE胎盤組織中SOD和GSH-Px水平明顯降低，MDA水平明顯升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16-17]。SIRT3作為線粒體抗氧化應(yīng)激中重要調(diào)控因子，通過顯著提升抗氧化系統(tǒng)里各類酶活性，使得線粒體中的ROS清除率有效增加，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用。如SIRT3可直接去乙?；瘉砑せ羁寡趸蜃渝i超氧化物歧化酶(MnSOD)和異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)[18]。因此，用300μmol/L CoCl2處理HTR-8/SVneo細(xì)胞24h模擬胎盤氧化應(yīng)激環(huán)境[19]。本研究發(fā)現(xiàn),滋養(yǎng)細(xì)胞中SIRT3表達(dá)隨著CoCl2濃度增加而減少，這與eoPE孕婦胎盤中SIRT3表達(dá)下調(diào)一致，表明滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型可行，也證明SIRT3與滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)有相關(guān)性。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SIRT3的HTR-8/SVneo細(xì)胞活性氧含量明顯減少，SOD和GSH-Px活性顯著增強(qiáng)，MDA產(chǎn)生減少。這提示SIRT3在eoPE患者胎盤組織中表達(dá)減少可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞功能，引起胎盤線粒體功能障礙，影響子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)，從而導(dǎo)致eoPE發(fā)生。

Akt信號(hào)通路在PE發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲、遷移和氧化應(yīng)激等密切相關(guān)[20]。研究報(bào)道,在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，SIRT3能與Akt免疫共沉淀并與Akt共定位，這表明SIRT3通過轉(zhuǎn)錄后修飾促進(jìn)Akt通路的激活[21]。此外，SIRT3過表達(dá)通過抑制ROS積累和激活A(yù)kt/FoxO信號(hào)通路來拮抗高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡[22]。因此，推測(cè)SIRT3可能通過Akt信號(hào)通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)SIRT3滋養(yǎng)細(xì)胞中Akt和p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)明顯增加，且p-GSK3β(Ser9)和p-c-Raf表達(dá)增加，而p-PDK1蛋白表達(dá)減少。PDK1對(duì)Akt的磷酸化是激活A(yù)kt的重要機(jī)制，PDK1/Akt通路的激活可影響各項(xiàng)細(xì)胞活動(dòng)，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移[23]。過表達(dá)SIRT3滋養(yǎng)細(xì)胞中p-PDK1/PDK1下調(diào)，似乎不能解釋p-Akt(Thr308)升高。但表明SIRT3可能分別對(duì)PDK1和Akt直接調(diào)節(jié)，這可能是其復(fù)雜功能的基礎(chǔ)。后續(xù)還需在滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型上，使用Akt信號(hào)通路的激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，SIRT3可能通過調(diào)控Akt信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲遷移，緩解滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激，其表達(dá)失調(diào)參與eoPE的發(fā)生和發(fā)展。今后將從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平和動(dòng)物模型整體水平深入探究滋養(yǎng)細(xì)胞中SIRT3的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以期為eoPE防治提供新的方向和理論基礎(chǔ)。