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    油莎豆基因組大小、倍性和系統(tǒng)發(fā)育分析

    2023-03-22 12:41:30王會(huì)偉朱世新張新友楊鐵鋼張向歌王樹(shù)峰李春鑫
    河南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年1期
    關(guān)鍵詞:莎豆油莎莎草

    王會(huì)偉,朱世新,張新友,王 艷,楊鐵鋼,張向歌,王樹(shù)峰,李春鑫

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,河南 鄭州 450002;2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)院,河南 鄭州 450001)

    我國(guó)是世界上植物油第一生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó),受限于國(guó)內(nèi)產(chǎn)量,植物油供給對(duì)外依存度較高,已成為我國(guó)食用油供給安全的重大隱患。油莎豆(Cyperus esculentusL.)單產(chǎn)高、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、綠色健康、耐澇節(jié)水[1-2],是助力植物油自主供給、發(fā)展健康飲食的理想作物[3]。目前,油莎豆已被科技部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作為重要的新興油源作物進(jìn)行推廣,2021年,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其正式列入“十四五”全國(guó)種植業(yè)發(fā)展規(guī)劃。

    油莎豆屬于莎草科(Cyperaceae Juss.)、莎草屬(CyperusL.),該屬全世界約有600 種,分布于溫帶、亞熱帶和熱帶地區(qū),我國(guó)有60 多種[4]。油莎豆自20世紀(jì)50年代引入我國(guó)種植以來(lái),由于種源多采用塊莖營(yíng)養(yǎng)繁殖,未經(jīng)過(guò)現(xiàn)代育種技術(shù)改良,退化嚴(yán)重。目前,完善的油莎豆良種繁育技術(shù)和優(yōu)異種質(zhì)資源非常匱乏[5]。這主要是因?yàn)橛蜕寡芯炕A(chǔ)薄弱,種質(zhì)資源的遺傳背景不明。因此,對(duì)油莎豆基因組大小、倍性和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析是油莎豆遺傳改良和育種的基礎(chǔ)。但是,目前此方面的研究非常少[6]。ZONNEVELD[6]在2019 年利用流式細(xì)胞儀分析了荷蘭油莎豆,發(fā)現(xiàn)其基因組約為0.669 Gb,并推測(cè)其為二倍體。通過(guò)測(cè)序來(lái)評(píng)估物種基因組大小和特性,是一種高效的方法。該方法已在研究基礎(chǔ)薄弱的動(dòng)植物遺傳背景分析中得到廣泛應(yīng)用[7-8],但目前尚沒(méi)有利用該技術(shù)對(duì)油莎豆基因組進(jìn)行研究的報(bào)道。為此,通過(guò)流式細(xì)胞儀和基因組Survey 分析對(duì)黃淮地區(qū)油莎豆主栽品種和特色種質(zhì)資源的基因組大小、倍性進(jìn)行研究,并進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析,為明確我國(guó)油莎豆種質(zhì)的遺傳背景奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試油莎豆為豫油莎1 號(hào)(C.esculentusL.‘Yuyousha 1’,中圓粒)、豫油莎2 號(hào)(C.esculentusL.‘Yuyousha 2’,中圓粒)、豫油莎3 號(hào)(C.esculentusL.‘Yuyousha 3’,中長(zhǎng)粒)、豫油莎5 號(hào)(C.esculentusL.‘Yuyousha 5’,中圓粒)、中油莎1 號(hào)(C.esculentusL.‘Zhongyousha 1’,中圓粒)、YYS-4(C.esculentusL.‘YYS-4’,大粒),均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所油莎豆育種研究室提供。其中,豫油莎1號(hào)、豫油莎2 號(hào)、豫油莎5 號(hào)和中油莎1號(hào)為主栽品種,豫油莎3號(hào)和YYS-4為特色種質(zhì)資源。

    1.2 基因組大小、倍性分析

    1.2.1 流式細(xì)胞儀分析 取6~8 葉期的6 個(gè)油莎豆材料的新鮮葉片20 mg 放在塑料培養(yǎng)皿的中心,添加1 mL 預(yù)冷的細(xì)胞核裂解液(45 mmol/L MgCl2·6H2O、20 mmol/L MOPS、30 mmol/L 檸檬酸鈉、10 mmol/L Na2EDTA、20 mL/L β-巰基乙醇、2% PVP-40、0.5% Triton X-100、0.1% Tween 20,pH 值7.0,-20 ℃下保存,解凍后4 ℃保存)到培養(yǎng)皿中,用刀片將葉片切碎,整個(gè)過(guò)程在冰袋上操作且保證葉片始終浸沒(méi)在裂解液中,上下混合勻漿數(shù)次,將勻漿過(guò)濾到標(biāo)記樣品管中,加入DNA 熒光鉻的儲(chǔ)備溶液,輕輕搖動(dòng)。分析前在冰上孵育樣品,偶爾搖晃。用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Accuri C6)測(cè)量染色核的相對(duì)熒光。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,變異系數(shù)控制在5%以內(nèi),以小麥(基因組為17 Gb)為參照。測(cè)定所得圖像和數(shù)據(jù)由流式細(xì)胞儀自帶軟件進(jìn)行處理分析?;蚪M大小=(樣品熒光強(qiáng)度/參照熒光強(qiáng)度)×參照基因組大小。

    1.2.2 Survey分析

    1.2.2.1 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 取6~8 葉期3 種粒型油莎豆材料[豫油莎2 號(hào)(中圓粒)、豫油莎3 號(hào)(中長(zhǎng)粒)和YYS-4(大粒)]的葉片,用改良的CTAB 方法提取基因組DNA[9]。用Nano Drop 2000 分光光度計(jì)(Nano DropTechnologies,Wilmington,DE,USA)、Qubit 3.0 熒光計(jì)(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)檢測(cè)其濃度和質(zhì)量。然后3 個(gè)材料各取1 μg DNA 采用MGI DNA 文庫(kù)通用試劑盒(諾唯贊,南京)構(gòu)建文庫(kù),對(duì)每個(gè)樣本添加index。文庫(kù)構(gòu)建完成后,使用Qubit 3.0熒光計(jì) 和Bioanalyzer 2100 系 統(tǒng)(Agilent Technologies,CA,USA)測(cè)定文庫(kù)中樣品的濃度和片段大小分布,以確定合適的上機(jī)pooling 方案。文庫(kù)檢測(cè)合格后,在MGI-SEQ 2000 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序,具體測(cè)序服務(wù)由武漢菲沙基因信息有限公司提供。

    1.2.2.2 Survey 分析 在二代測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后,利用HTQC(v1.92.310)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾,過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)如下:去除接頭序列和PCR 擴(kuò)增等原因引起的冗余序列;去除單端測(cè)序讀長(zhǎng)中的一端含有的N含量占比超過(guò)10%的測(cè)序片段;去除測(cè)序片段中的一端含有的低質(zhì)量堿基數(shù)(≤5)占比超過(guò)50%的片段,得到高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)。參照LIU 等[10]的方法,通過(guò)GCE(Genome characteristics estimation)軟 件 的K-mer預(yù)估油莎豆的基因組大小、雜合率、重復(fù)序列占比及基因組倍性等,分析時(shí)采用K=17[11]。

    1.2.3 花粉活力測(cè)定 挑選6個(gè)油莎豆材料即將散粉的單株,將其整個(gè)花器剪下,取少許花粉于載玻片上,滴加2~3 滴醋酸洋紅溶液,覆蓋載玻片,放在體視鏡(50×)下觀察花粉粒的染色情況。

    1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

    用DNA 提取試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]提取6個(gè)油莎豆材料的總DNA,然后進(jìn)行核糖體DNA 的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)(ITS1-5.8S rDNA-ITS2)和 外 轉(zhuǎn) 錄 間 隔 區(qū)(External transcribed spacer,ETS)序列擴(kuò)增,其中,ITS序列的引物為SE17(5′-ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTC-3′)和SE26(5′-TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3′)[12],ETS 序列的引物為ETS-F(5′-CTGTGGCGTCGCATGAGTTG-3′)和18S-R(5′-AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG-3′)[13]。PCR 擴(kuò)增體系:12.5 μL 的2×TaqPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司],11.2 μL ddH2O,正、反向引物各0.5 μL(10 μmol/L),0.3 μL模板DNA,總體積為25 μL。擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物交河南尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。

    從GenBank中獲取長(zhǎng)尖莎草(C.cuspidatusH.B.K.)、異型莎草(C.difformisL.)、油莎豆(C.esculentusL.)、褐穗莎草(C.fuscusL.)、頭狀穗莎草(C.glomeratusL.)、畦畔莎草(C.haspanL.)、碎米莎草(C.iriaL.)、香附子(C.rotundusL.)、白毛羊胡子草(Eriophorum vaginatumL.)的ITS 和ETS 基因(表1),與6 個(gè)油莎豆材料的ITS 和ETS 基因用MAFFT[14]進(jìn)行多序列比對(duì),然后將比對(duì)后的序列聯(lián)合用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。以白毛羊胡子草作為外類群,采用最大似然法(Maximum likelihood,ML)和 貝 葉 斯 推 論 法(Bayesian inference,BI)在Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research(CIPRES)Science Gateway(https://www.phylo.org/)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用RAxML(Randomized axelerated maximum likelihood)-HPC2 構(gòu)建ML 樹(shù)[15],采用MrBayes Restart on XSEDE(3.2.x)構(gòu)建BI 樹(shù)[16],參數(shù)設(shè)置參考WEI 等[17]的方法。在ML 樹(shù)中BS(自展支持率)≥70%結(jié)果可靠[17],在BI 樹(shù)中PP(后驗(yàn)概率)≥0.95 結(jié)果可靠[16],最終結(jié)果保留BS≥70%或PP≥0.95 的節(jié)點(diǎn)數(shù)值。最后用TreeGraph 2[18]查看、注解系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

    表1 油莎豆近源類群ITS和ETS序列的GenBank登錄號(hào)Tab.1 Accession numbers of ITS and ETS of closely related species ofC.esculentusL.from GenBank

    2 結(jié)果與分析

    2.1 油莎豆基因組大小分析

    2.1.1 基于流式細(xì)胞儀的基因組大小評(píng)估 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明,6 個(gè)油莎豆材料的熒光峰對(duì)應(yīng)的基因組大小為0.808 6~0.858 5 Gb(圖1、表2),均值為0.826 0 Gb。其中,大粒材料(YYS-4)基因組最大,為0.858 5 Gb,中長(zhǎng)粒材料(豫油莎3 號(hào))為0.831 1 Gb,豫油莎1 號(hào)、豫油莎2 號(hào)、豫油莎5 號(hào)和中油莎1 號(hào)等4 個(gè)中圓粒材料基因組均值為0.817 2 Gb。綜上,6 個(gè)油莎豆材料的基因組大小差異不明顯。

    表2 基于流式細(xì)胞儀的6個(gè)油莎豆材料基因組大小評(píng)估Tab.2 Evaluation of genome size of sixC.esculentusL.materials by flow cytometry

    圖1 6個(gè)油莎豆材料的流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果Fig.1 The determination results of sixC.esculentusL.materials by flow cytometry

    2.1.2 基于Survey 分析的基因組大小評(píng)估 為進(jìn)一步準(zhǔn)確評(píng)估油莎豆基因組大小,對(duì)3 種粒型油莎豆材料(豫油莎2 號(hào):中圓粒;豫油莎3 號(hào):中長(zhǎng)粒;YYS-4:大粒)進(jìn)行基因組Survey分析。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控篩選,獲得測(cè)序數(shù)據(jù)量分別為豫油莎2 號(hào)58.70 Gb、豫油莎3 號(hào)52.60 Gb、YYS-4 64.36 Gb,測(cè)序深度分別為豫油莎2 號(hào)82×、豫油莎3 號(hào)66×、YYS-4 79×,Q20 均在95%以上,Q30 均在90%以上(表3),符合后續(xù)分析質(zhì)控要求。

    表3 3種粒型油莎豆材料高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果Tab.3 Results of high quality sequence data of three tuber types ofC.esculentusL.

    以過(guò)濾后的高質(zhì)量數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用軟件GCE基于K-mer(K=17)的方法估計(jì)基因組大小和雜合率及重復(fù)序列信息。結(jié)果(表4)顯示,3種粒型油莎豆材料豫油莎2 號(hào)、豫油莎3 號(hào)、YYS-4 基因組分別為0.697 9、0.778 7、0.790 6 Gb。3 種粒型油莎豆材料的雜合率均較低,其中,豫油莎2 號(hào)雜合率最高,為0.28%,豫油莎3 號(hào)雜合率僅為0.08%;重復(fù)序列占比在材料間基本相似,最高的豫油莎3 號(hào)為84.45%,最低的豫油莎2 號(hào)為81.02%;豫油莎3 號(hào)GC 含量最高為36.4%,豫油莎2 號(hào)和YYS-4 的GC含量非常接近,分別為34.7%和34.9%。

    表4 3種粒型油莎豆材料的基因組特征信息Tab.4 Genome survey on three tuber types ofC.esculentusL.

    2.2 油莎豆基因組倍性分析

    對(duì)基因組K-mer深度分布(K=17)情況(圖2)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn) 3個(gè)油莎豆材料均出現(xiàn)了 3個(gè)峰,且主峰與后面2個(gè)峰大約呈整數(shù)倍(1∶2∶3)關(guān)系,由此推測(cè)3個(gè)材料的倍性相同,可能均為三倍體。

    圖2 3種粒型油莎豆材料K-mer深度分布Fig.2 The K-mer depth distribution of three tuber types ofC.esculentusL.

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證油莎豆基因組倍性結(jié)果,利用醋酸洋紅對(duì)6 個(gè)油莎豆材料的花粉進(jìn)行染色,結(jié)果顯示,6個(gè)材料的花粉中深紅色花粉粒占比均不超過(guò)2%,且部分材料中大量出現(xiàn)了不規(guī)則狀敗育花粉粒(圖3),說(shuō)明6 個(gè)材料的花粉粒均高度不育,從側(cè)面支持了基因組K-mer分析對(duì)油莎豆倍性的推斷。

    圖3 6個(gè)油莎豆材料花粉粒醋酸洋紅染色結(jié)果Fig.3 Staining results of pollen grains of sixC.esculentusL.materials with magenta acetate

    2.3 油莎豆系統(tǒng)發(fā)育分析

    基于ITS 和ETS 聯(lián)合序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4),發(fā)現(xiàn)6 個(gè)油莎豆材料(豫油莎1 號(hào)、豫油莎2號(hào)、豫油莎3 號(hào)、豫油莎5 號(hào)、YYS-4 和中油莎1 號(hào))和從GenBank 下載的油莎豆聚為一支,稱為油莎豆分支(BS=100%,PP=1)。在油莎豆分支中,豫油莎1號(hào)、豫油莎2 號(hào)和豫油莎5 號(hào)構(gòu)成一個(gè)高支持率的小分支(BS=99%,PP=1),與中油莎1 號(hào)形成姐妹群,然后它們共同與豫油莎3號(hào)構(gòu)成姐妹群。另外,油莎豆分支與香附子(C.rotundusL.)和頭狀穗莎草(C.glomeratusL.)構(gòu)成的分支(BS=100%,PP=1)形成親緣關(guān)系較近的姐妹群。

    圖4 基于ITS和ETS聯(lián)合序列構(gòu)建的油莎豆與近緣類群的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree ofC.esculentusL.and closely related species based on ITS and ETS concatenate sequences

    油莎豆與頭狀穗莎草、香附子、碎米莎草(C.iriaL.)、長(zhǎng)尖莎草(C.cuspidatusH.B.K.)等物種均為C4植物,共同構(gòu)成C4分支(BS=100%,PP=1);而C3植物異型莎草(C.difformisL.)和褐穗莎草(C.fuscusL.)形成一支(BS=100%,PP=1),與C4分支構(gòu)成姐妹群;畦畔莎草(C.haspanL.)位于莎草屬基部。

    3 結(jié)論與討論

    本研究中基因組Survey 分析結(jié)果表明,3 種代表粒型油莎豆材料中,YYS-4 基因組最大,其次是豫油莎3 號(hào)、豫油莎2 號(hào),這與流式細(xì)胞儀分析結(jié)果的趨勢(shì)相符,但具體數(shù)值小于流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果,大于ZONNEVELD[6]的結(jié)果。另外,根據(jù)K-mer分析結(jié)果,推測(cè)油莎豆為三倍體,油莎豆花粉粒高度敗育的觀察結(jié)果驗(yàn)證了該推測(cè),但考慮到莎草科物種細(xì)胞學(xué)事件活躍,這一推論需要更多直接試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

    分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)是根據(jù)生物大分子包含的遺傳信息建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),推斷生物有機(jī)體間的遺傳與進(jìn)化關(guān)系,進(jìn)而明確屬間或?qū)傧赂鞣诸惾褐g的關(guān)系[19]。本研究結(jié)果顯示,6 個(gè)油莎豆材料間親緣關(guān)系較近,互為姐妹類群。其中,豫油莎1 號(hào)、2 號(hào)親緣關(guān)系最近,與豫油莎5 號(hào)、中油莎1 號(hào)稍遠(yuǎn),再次為豫油莎3 號(hào),YYS-4 與以上5 個(gè)材料的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。另外,油莎豆與香附子和頭狀穗莎草的親緣關(guān)系較近,這與LARRIDON 等[20]的研究結(jié)果一致。REN 等[21]基于葉綠體全基因組對(duì)13 個(gè)物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果顯示,在莎草屬分支中,栽培種油莎豆和香附子聚為一小支且有很高的支持率,褐穗莎草、頭狀穗莎草和異型莎草聚為一小支且有很高的支持率,兩小支形成姐妹群,并獲得很高的支持率。在本研究結(jié)果中,6 個(gè)油莎豆材料聚為具有高支持率的一支,香附子與頭狀穗莎草聚為一小支,且有很高的支持率,并與油莎豆形成姐妹群,獲得很高的支持率;但褐穗莎草和異型莎草聚為一小支且有很高的支持率,與油莎豆親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究結(jié)果與REN 等[21]的結(jié)果有所差異,可能的原因有兩點(diǎn)。首先,所選類群有差異。REN 等[21]選用的莎草屬物種僅有5 個(gè),而本研究選取了河南省主栽油莎豆品種4 個(gè)、特色種質(zhì)2 個(gè)及莎草屬的其他物種7 個(gè)。其次,用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的序列不同。REN 等[21]選用的是葉綠體全基因組,而本研究選用的是核基因片段(ETS 和ITS)。葉綠體基因組進(jìn)化速率適中,且為單親遺傳;而核基因能夠提供更多的信息位點(diǎn),且為雙親遺傳,有助于發(fā)現(xiàn)進(jìn)化過(guò)程中的雜交和多倍化事件。然而,核基因序列為多拷貝,且存在致同進(jìn)化不完全現(xiàn)象,導(dǎo)致不同拷貝間的序列有差異,限制了其在系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用。因此,不同的基因有不同的特點(diǎn),結(jié)合多基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)會(huì)獲得更全面準(zhǔn)確的結(jié)果。另外,莎草屬物種進(jìn)化歷史復(fù)雜,進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了多倍化、基因漸滲等現(xiàn)象[22]。因此,結(jié)合多種手段的分析結(jié)果才能真實(shí)地反映油莎豆與近緣野生種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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