不同后熟處理對烤煙上部葉烘烤質(zhì)量的影響

軒棟棟，賈宏昉，郭仕平，謝良文，伍德洋，秦艷青，楊興有，馮長春

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.四川省煙草公司，四川 成都 610000；3.四川省煙草公司涼山州公司，四川 涼山 615000）

上部煙葉是烤煙單株生產(chǎn)力的重要組成部分。優(yōu)質(zhì)的烤煙上部葉在卷煙產(chǎn)品設(shè)計中占有非常重要的地位。但近年來，我國烤煙成熟度不夠、上部葉可用性不高，無法在工業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模用于優(yōu)質(zhì)卷煙的生產(chǎn)，成了煙草工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的焦點矛盾之一?？緹熒喜咳~物質(zhì)積累較多、組織結(jié)構(gòu)緊密、煙堿含量偏高、還原糖及糖堿比低、內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，在烘烤過程中常存在定色難、易掛灰、青筋煙比例高等問題[1]。因此，采取有效措施提高上部葉成熟度和品質(zhì)，對提高烤煙上部葉可用性具有重要意義。

烤前預(yù)先對煙葉進(jìn)行后熟處理可以使煙葉形成失水脅迫，增加葉片與主脈的水勢差，促進(jìn)主脈水分向葉片遷移散失，進(jìn)而調(diào)整主脈失水，保證煙葉的失水協(xié)調(diào)[2]；相關(guān)研究表明，后熟失水凋萎后煙葉的生理代謝加快，變黃時間縮短[3]。目前，后熟技術(shù)在實際應(yīng)用中多用于香蕉、獼猴桃、軟肉梨等，以提高水果的色澤和品質(zhì)[4-5]。在烤煙中后熟技術(shù)的研究多關(guān)注于烘烤過程中煙葉的失水特性及形態(tài)變化[6-7]，而對其成熟度、內(nèi)含物變化、褐變機(jī)制等未進(jìn)行充分闡述。為此，設(shè)置4個不同的后熟處理，對煙葉褐變程度、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、糖類物質(zhì)含量、脂肪酸含量、糖代謝和脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行分析，旨在研究后熟處理對烤煙上部葉成熟度和烘烤品質(zhì)的影響，以期為提高烤煙上部葉質(zhì)量和可用性提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021 年在四川省涼山州鹽源縣基地開展，品種為云煙87，選取上部葉為供試材料。

1.2 試驗設(shè)計

在當(dāng)?shù)責(zé)熑~適熟季節(jié)，采收落黃均勻、長相一致的上部葉（第13～16 片葉），設(shè)置正常采烤煙葉（CK）、12 h 后熟處理煙葉（H1）、24 h 后熟處理煙葉（H2）、36 h 后熟處理煙葉（H3）共4 個處理。每個處理5桿，放入密閉空置烤房中進(jìn)行后熟處理，放置至試驗計劃時間后移入烤房內(nèi)，與當(dāng)?shù)卣２煽緹熑~一起開始烘烤。同時各處理取10片煙葉，用于細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察、脂肪酸含量和脂氧合酶（LOX）活性測定。烘烤完成后，各處理取10 片烤后樣，用于還原糖、總糖和淀粉含量的測定。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 褐變程度測定 每個處理選取烘烤過程中的5 片煙葉用于褐變程度測定，采用Photoshop 像素法[8]計算煙葉變褐部分面積與總?cè)~片面積（圖1），從煙葉烘烤開始每隔24 h 進(jìn)行褐變比例統(tǒng)計，測定變褐程度，計算變褐速度。

圖1 Photoshop像素法示例Fig.1 Photoshop pixel method example

1.3.2 經(jīng)濟(jì)性狀統(tǒng)計 依據(jù)GB 2635—92中的方法對烤煙進(jìn)行分級，計產(chǎn)計值[9]。

1.3.3 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察 選取各處理葉片第5到第7 支脈之間右側(cè)相同的位置，用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm 的小塊，立即放入2.5%戊二醛溶液（pH值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS 緩沖液配制）中固定。透射電鏡觀察角質(zhì)層：用1%鋨酸（pH 值7.2～7.4，0.1 mol/L PBS緩沖液配制）固定，經(jīng)純丙酮脫水后用Epon812 環(huán)氧樹脂包埋聚合；用Leica EM UC6 Miultracut 超薄切片機(jī)（德國Wetzlar 公司）切出超薄切片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，再用JEM-1400 Plus 型透射電鏡（日本電子株式會社）進(jìn)行觀察并拍照；每個處理觀察10 個視野，同時測定淀粉粒數(shù)量和面積[10]。

1.3.4 還原糖、總糖和淀粉含量測定 取不同處理烤后樣，采用德國seal AA 流動分析儀測定還原糖、總糖和淀粉含量[11]。

1.3.5 脂肪酸含量測定 煙葉脂肪酸含量采用YC/T 288—2009《煙草及煙草制品 多元酸（草酸、蘋果酸和檸檬酸）的測定 氣相色譜法》中的方法進(jìn)行測定[12]。

1.3.6 LOX 活性的測定 LOX 活性采用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的酶活性試劑盒按照說明書方法進(jìn)行測定。

1.3.7 糖代謝及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)量測定

在變黃期42 ℃烘烤72 h時選取各處理葉片，使用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit（上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司）提取煙葉總RNA，測定所提總RNA 的OD260/280值，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，使用HiScript?Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為qRT-PCR 反應(yīng)的模板。引物（表1）設(shè)計采用Primer Premier 5.0 軟件。qRT-PCR 反應(yīng)按照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行，3 次重復(fù)，內(nèi)參基因為煙草組成型表達(dá)基因NtL25?；虮磉_(dá)量采用2-△△Ct法計算。

表1 煙草糖代謝及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences of genes related to glucose metabolism and lipid metabolism in tobacco

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同后熟處理對烤煙上部葉褐變的影響

褐變比例分析結(jié)果表明（圖2A），烘烤過程中后熟處理煙葉褐變時間發(fā)生晚，褐變速度慢，褐變比例降低，并隨后熟時間的增加效果呈上升趨勢。對烤后煙葉褐變情況結(jié)果分析，各后熟處理煙葉褐變現(xiàn)象均有所降低，其中H2 處理最為顯著，輕度褐變煙葉比例較CK 處理下降34.39%，中度及以上褐變煙葉比例下降 43.02%（圖 2B）。說明后熟處理對降低上部葉褐變程度有著重要作用。同時烤后煙葉各等級比例統(tǒng)計結(jié)果顯示，各后熟處理煙葉上等煙比例分別提高3.63%、17.29%、7.70%，H2 處理整體中上等煙比例較CK 處理提高5.39%，在提高烤后煙葉品質(zhì)方面效果顯著。

圖2 不同后熟處理煙葉烘烤中褐變比例（A）和烤后煙等級（B）Fig.2 Browning ratio（A）and cured tobacco grade of tobacco leaves（B）with different post-ripening treatments

2.2 不同后熟處理烤煙上部葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

為研究不同后熟處理對烤煙上部葉細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)的影響，通過透射電鏡對上部葉發(fā)育結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，如圖3所示，正常處理煙葉細(xì)胞柵欄組織中葉綠體及其他細(xì)胞器均近細(xì)胞壁分布；葉綠體所含淀粉粒數(shù)量多，體積??；嗜鋨顆粒含量少且體積相對較小。隨著后熟時間的增加，煙葉中葉綠體及其他細(xì)胞器逐漸在細(xì)胞腔中游離分布，淀粉粒體積增大，數(shù)量減少，嗜鋨顆粒含量增多且體積增大。不同處理烤后煙葉的淀粉、總糖、還原糖含量的測定結(jié)果顯示（表2），與CK 處理相比，后熟處理的煙葉淀粉含量降低，總糖和還原糖含量升高。其中，H2處理還原糖和總糖含量分別提高53.33% 和16.33%，H3處理淀粉含量降低5.61%。

圖3 不同后熟處理烤煙細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察（×5 000）Fig.3 Observation on cell ultrastructure of flue-cured tobacco with different post-ripening treatments（×5 000）

表2 不同后熟處理煙葉的淀粉粒數(shù)量、面積及烤后樣化學(xué)成分含量Tab.2 The quantity，area of starch granules and chemical composition in flue-cured tobacco leaves after different post-ripening treatments

續(xù)表2 不同后熟處理煙葉的淀粉粒數(shù)量、面積及烤后樣化學(xué)成分含量Tab.2（Continued）The quantity，area of starch granules and chemical composition in flue-cured tobacco leaves after different post-ripening treatments

2.3 不同后熟處理烤煙上部葉LOX活性及脂肪酸含量分析

如圖4所示，通過不同時間后熟處理的上部葉，除肉豆蔻酸外（圖4A），各脂肪酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢，其中3 個后熟處理在棕櫚酸含量和花生酸含量上降低最為明顯，均達(dá)到極顯著差異（圖4B、D）。H3 處理的硬脂酸含量和亞油酸含量相較CK 處理分別降低35.61%、25.77%，達(dá)極顯著差異（圖4C、F）。脂肪酸含量整體隨后熟時間的增加呈下降趨勢（圖4G），同時LOX活性增加（圖4H），這表明后熟處理對提高上部葉成熟度作用明顯。

圖4 不同后熟處理煙葉脂肪酸含量和LOX活性分析Fig.4 Analysis of fatty acid content and LOX activity in different post-ripening treatments of tobacco leaves

2.4 不同后熟處理對烤煙上部葉脂質(zhì)代謝及糖代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

從圖5 可以看出，在煙葉變黃關(guān)鍵時期測定蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGP）表達(dá)量，結(jié)果顯示，隨后熟時間的增加，糖代謝途徑關(guān)鍵基因SS、INV和AGP表達(dá)量均呈下降趨勢，尤其是H2和H3處理的SS、INV基因表達(dá)量較CK 處理下降達(dá)極顯著水平。這表明后熟處理可以對煙葉的淀粉合成起抑制作用。后熟處理煙葉的 3個脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因表達(dá)量均呈下降趨勢，較長時間的后熟處理對基因表達(dá)量的影響較大，其中各后熟處理脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因1（LTP1）較CK 處理均極顯著降低，H3 處理的蠟質(zhì)合成基因10（CER10）、MYB 家族基因48（MYB48）相對表達(dá)量分別極顯著降低85.40%、74.39%。這說明經(jīng)過后熟處理，煙葉在烘烤過程中的脂質(zhì)代謝水平有很大程度的降低。

圖5 不同后熟處理煙葉脂質(zhì)代謝及糖代謝途徑關(guān)鍵基因相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of key genes in lipid metabolism and glucose metabolism pathway in different post-ripening treatments of tobacco leaves

3 結(jié)論與討論

烤煙上部葉多存在著葉片偏厚、色深、組織結(jié)構(gòu)緊密、成熟度較差、內(nèi)在化學(xué)成分不協(xié)調(diào)等一系列的問題，這就導(dǎo)致了上部葉烘烤品質(zhì)差，可用性不高。本研究以不同后熟處理的云煙87 上部葉為供試材料，研究證明后熟處理能有效提高上部葉成熟度，在烘烤過程中褐變速度減緩、褐變程度減輕，烤后煙中上等煙比例顯著提高。

烤煙的品質(zhì)與淀粉含量密切相關(guān)，煙草中淀粉的分解、轉(zhuǎn)化、消耗和積累決定著煙葉品質(zhì)和外觀等級的優(yōu)劣[13]。而糖代謝是淀粉積累分解的重要環(huán)節(jié)，受多種酶活性影響。其中蔗糖合成酶（SS）主要調(diào)節(jié)蔗糖的降解，為淀粉合成提供底物，其活性的高低與淀粉積累量相一致[14]；而蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）被認(rèn)為是控制淀粉合成的關(guān)鍵酶[15]；另外，焦磷酸化酶（AGP）為淀粉生物合成的限速酶，決定淀粉合成的速率和最終合成量[16]。因此，這3 個基因表達(dá)量的高低意味著煙葉中內(nèi)含物積累的狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，后熟處理煙葉中，這3個基因表達(dá)量均顯著降低，表明烘烤過程中淀粉的合成受到抑制，這與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果淀粉粒數(shù)量隨后熟時間的增加而減少，以及烤后煙葉淀粉含量顯著降低的結(jié)果相一致。

LOX 是一種廣泛存在于植物組織中以不飽和脂肪酸為底物的酶，在植物生長發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過程中起重要調(diào)節(jié)作用[17]。研究表明，LOX活性多隨植物的成熟衰老逐漸升高[18]。LOX活性測定分析表明，隨著后熟處理時間的增加，LOX活性逐漸升高，該結(jié)果一定程度上說明了后熟處理能有效提高煙葉成熟度。

上部葉烘烤過程中易掛灰褐變，嚴(yán)重影響了品質(zhì)和可用性。在其他作物上關(guān)于褐變的研究報道頗多，楊芳等[19]通過降低板栗的不飽和脂肪酸含量，減輕貯藏加工過程中的褐變反應(yīng)；李靜等[20]通過延緩雙孢菇脂質(zhì)過氧化進(jìn)程，降低其褐變指數(shù)；洪宇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下隨著玉米褐變程度加深，其脂肪酸含量增加。這都說明脂質(zhì)氧化對褐變反應(yīng)有重要影響。這與后熟處理后煙葉不飽和脂肪酸含量降低，烘烤過程中褐變速度減緩、褐變程度減輕的結(jié)果相一致。

煙葉在烘烤過程中脂肪酸的代謝氧化是一系列復(fù)雜的生理生化過程，是內(nèi)在分子機(jī)制調(diào)控的結(jié)果，與多種基因的表達(dá)有關(guān)。本研究選取3 個與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，其相對表達(dá)量測定分析結(jié)果表明，與正常處理煙葉相比，24 h 和36 h 后熟處理煙葉相關(guān)基因表達(dá)量均下調(diào)，且差異顯著。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LTP）能夠結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)多種脂質(zhì)，參與多種脂質(zhì)代謝反應(yīng)，受LTP 基因家族編碼調(diào)控[22]。后熟處理煙葉在烘烤過程中LTP1基因相對表達(dá)量均顯著降低。烯醇輔酶a 還原酶（ECR）是合成超長鏈脂肪酸（VLCFA）所需的一種酶，在擬南芥中被證實參與了所有VLCFA 伸長反應(yīng)，并被確定由CER10基因編碼[23]。后熟處理煙葉CER10基因表達(dá)量下調(diào)，這可能與后熟處理后煙葉脂肪酸含量降低有關(guān)。MYB 是真核生物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，其成員在植物的生長發(fā)育、次生物質(zhì)代謝、生物及非生物脅迫應(yīng)答等多種生理過程中發(fā)揮重要作用[24]。有研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子可能參與了生物脂質(zhì)合成調(diào)控，在脂質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于上游位置[25]。后熟處理煙葉中MYB48基因表達(dá)量降低，說明在烘烤過程中脂質(zhì)合成受阻。

煙葉烘烤是脫水干燥的物理過程和內(nèi)部生物化學(xué)變化過程的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。提高煙葉烘烤質(zhì)量除對烘烤工藝進(jìn)行調(diào)整改善外，更重要的是要提升煙葉自身品質(zhì)。上部葉存在烘烤品質(zhì)差、可用性低問題的根本原因是，上部葉自身存在成熟度不夠、內(nèi)部化學(xué)成分不協(xié)調(diào)等生理缺陷。本研究利用后熟處理技術(shù)對上部葉進(jìn)行處理，在提高煙葉成熟度、降低褐變程度和提高烤后煙等級等方面初見成效，并從生物細(xì)胞學(xué)、物質(zhì)代謝和分子層面對其內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行了初步探究。但對其復(fù)雜內(nèi)在機(jī)制的研究仍有大量的不足，后期將通過基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)一步深入研究。

本研究對后熟處理煙葉進(jìn)行褐變程度分析、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察、糖類和脂肪酸含量測定以及糖代謝和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)分析，并對烤后煙進(jìn)行分級驗證其實際效果，為通過后熟處理提高上部葉品質(zhì)和可用性提供參考。