PCR-DGGE技術(shù)分析韓式大醬與中式大醬中微生物多樣性

曾玲，金清

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉，133002)

東北三省素有“大豆之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，其大豆制品通常分為發(fā)酵豆制品和非發(fā)酵豆制品。傳統(tǒng)發(fā)酵大豆食品包括豆醬、豆豉、豆?jié){、醬油、臭豆腐與腐乳等產(chǎn)品[1]。而東北傳統(tǒng)大醬是以大豆為原料，經(jīng)天然存在的細(xì)菌和真菌發(fā)酵而成的半固體狀調(diào)味食品[2]。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，厭氧菌快速繁殖，微生物群落的動(dòng)態(tài)變化會(huì)對(duì)大醬發(fā)酵產(chǎn)生一定的影響[3]，蛋白質(zhì)在酶的作用下分解為小分子的肽、氨基酸，從而產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味。因此傳統(tǒng)發(fā)酵大豆制品營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)地獨(dú)特、風(fēng)味醇厚，且在其發(fā)酵過(guò)程中會(huì)發(fā)生非酶褐變并產(chǎn)生褐色物質(zhì)——類黑精，即大豆中富含的蛋白質(zhì)及其分解產(chǎn)物與還原糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[4-5]。類黑精作為非消化性高分子物質(zhì)，除具有食物纖維的生理功能外[6]，還具有降血壓[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]等多種作用生物活性。

但傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵工藝為自然發(fā)酵，因此其品質(zhì)因參與發(fā)酵的微生物種類而異?；?6S rRNA與26S rRNA基因的非培養(yǎng)技術(shù)能夠揭示微生物群落結(jié)構(gòu)，為規(guī)避傳統(tǒng)微生物群落分析的局限性而開(kāi)發(fā)的各種非培養(yǎng)的方法中，變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)分析是用于快速、經(jīng)濟(jì)地研究微生物多樣性的最廣泛應(yīng)用的分子方法之一。一般在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，雙鏈DNA分子遷移距離由其分子大小與電荷決定，因此同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移距離相同，從而不能被區(qū)分出來(lái)，DGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上加入了變性劑梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。

因此，本研究以自制的韓式大醬與中式大醬為原料，不進(jìn)行微生物培養(yǎng)，直接提取樣品總DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)測(cè)定分子指紋圖譜，比較生物體所攜帶基因中的保留性結(jié)合序列(conserved region)來(lái)確認(rèn)微生物的變化，分析中式與韓式大醬中的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)傳統(tǒng)醬類由原材料和加工方法引起的發(fā)酵微生物群落變化進(jìn)行補(bǔ)充，為大醬的標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂糖，上海源葉生物科技有限公司；PBS、TAE緩沖液，江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒，廣州健侖生物科技有限公司；聚丙烯酰胺凝膠試劑盒，上海生工生物工程有限公司；SYBR Green，Invitrogen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1104分析天平，上海天平儀器有限公司；Z400K冷凍離心機(jī)，萊比信(中國(guó))科技發(fā)展有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器，日本TOMY公司；Bio-Rad T100型PCR儀、電泳儀、變形梯度電泳儀、GelDoc XR凝膠成像儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)，上海新苗醫(yī)療器械機(jī)械制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 韓式大醬制作工藝流程

大豆→浸泡→瀝水蒸煮→破碎→造型→稻草捆綁→吊掛→自然發(fā)酵→醬曲

醬曲→清洗晾曬→破碎→裝壇→加鹽水(25%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)→自然發(fā)酵→去除醬油→破碎→裝壇→撒食鹽→白布封口→封蓋發(fā)酵

1.3.2 中式大醬制作工藝流程

大豆→浸泡→瀝水蒸煮→破碎→造型→包裝紙包裝→自然發(fā)酵→醬曲

醬曲→清洗晾曬→破碎→裝壇→加鹽水(25%)→自然發(fā)酵

1.3.3 大醬樣品DNA提取

分別稱取10 g樣品與20 mL PBS(pH 7.0)混勻均質(zhì)并經(jīng)4層濾布過(guò)濾，將濾液于4 ℃下400×g離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS重復(fù)洗滌3次后重新加入3 mL PBS，使用基因組DNA提取試劑盒提取其DNA，并在10 g/L瓊脂糖凝膠上對(duì)DNA的產(chǎn)量與質(zhì)量進(jìn)行電泳分析，將提取DNA作為PCR模板以擴(kuò)增16S rRNA與26S rRNA基因[10]。

1.3.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系均為50 μL，體系包括5 μL 10×Buffer(含有Mg2+)，4 μL 25 mmol/L dNTP混合物，1 UTaqDNA聚合酶，每種引物50 pmol，DNA模板用量為1 μL。Reconditioning PCR用來(lái)消除普通PCR過(guò)程中的雜合雙鏈DNA污染。

A：16S rRNA基因V3區(qū)PCR擴(kuò)增條件：引物為341F GC和518R。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 1 min；65 ℃ 1 min(注：每循環(huán)二次后溫度降低1 ℃)；72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。Reconditioning PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 1 min：65 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，5至10個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

B：26S rRNA基因PCR擴(kuò)增條件：引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)與LS2(5′- ATTCCCAAACAACTCGACTC-3′)，并且在NL1的5′端上加入富含GC的DNA片段(5′-CGCCCGCCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGC-3′)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min進(jìn)入30個(gè)循環(huán)，94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。Reconditioning PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，8個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

1.3.5 DGGE

PCR產(chǎn)物采用Bio-Rad DCode檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析。將80 g/L聚丙烯酰胺凝膠置于TAE緩沖液中，上樣后在100 V下電泳200 min，并在40%～60%的變性梯度下實(shí)現(xiàn)了最佳分離，然后用SYBR green染色45 min，使用GelDoc XR凝膠成像儀對(duì)凝膠進(jìn)行拍照[11]。

1.3.6 DGGE條帶回收、PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參考鄭艷等[12]的方法，將DGGE后的凝膠，置于凝膠成像儀上，選取目標(biāo)條帶切割后放入無(wú)菌離心管中，加入60 μL的滅菌去離子水清洗后加入60 μL的滅菌去離子水并于4 ℃靜置過(guò)夜。取儲(chǔ)存樣品液2 μL作為PCR反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 韓式大醬與中式大醬中的細(xì)菌多樣性分析

擴(kuò)增大醬樣品中微生物的16S rRNA基因，并通過(guò)變性梯度凝膠電泳方法調(diào)查細(xì)菌的群落分布。韓式大醬PCR-DGGE結(jié)果如圖1所示，并對(duì)出現(xiàn)的每個(gè)條帶進(jìn)行堿基序列分析，鑒定結(jié)果如表1所示。韓式大醬中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優(yōu)勢(shì)種，其次為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)和嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。芽孢桿菌在發(fā)酵過(guò)程中能分泌多種酶類與抗生素，可協(xié)助真菌分解大豆中的蛋白質(zhì)和淀粉。此外，醬曲在清洗晾曬、破碎裝壇后使用鹽水浸泡發(fā)酵，分離出的四聯(lián)球菌屬和單胞菌屬都具有一定的耐鹽性，是大豆產(chǎn)品發(fā)酵過(guò)程中常接種的微生物之一[13]，可用于釀造醬油、腐乳、黃豆醬等制品中，改善產(chǎn)品風(fēng)味。

圖1 韓式大醬中16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprints of 16S rRNA amplification products in Korean soybean paste

表1 韓式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測(cè)序結(jié)果Table 1 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Korean soybean paste

中式大醬PCR-DGGE結(jié)果如圖2所示，并對(duì)出現(xiàn)的每個(gè)條帶進(jìn)行堿基序列分析，鑒定結(jié)果如表2所示。在中式大醬中，乳酸菌如片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leucanostoc)和腸桿菌屬(Enterobacter)均為優(yōu)勢(shì)種，且與芽孢桿菌屬相比分布更多。

圖2 中式大醬中16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprints of 16S rRNA amplification products in Chinese soybean paste

表2 中式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測(cè)序結(jié)果Table 2 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Chinese soybean paste

乳酸菌是人體腸道系統(tǒng)中最主要的有益菌，通常在發(fā)酵食品中分離得到，在成品醬風(fēng)味形成過(guò)程中也起到了重要作用，能產(chǎn)生良好的感官風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[14-16]。在大醬發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌將酪氨酸、精氨酸、組氨酸分解，對(duì)蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸等進(jìn)行異型脫羧基作用從而生成多類化合物，這些化合物對(duì)豆醬風(fēng)味形成有重要的貢獻(xiàn)。

左麗麗等[17]對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中乳酸菌進(jìn)行分離和鑒定，初步推斷出戊糖片球菌是吉林市農(nóng)家醬發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌群，對(duì)傳統(tǒng)豆醬的風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用。此外，不動(dòng)桿菌屬、四聯(lián)球菌屬和嗜鹽單胞菌屬也顯示為優(yōu)勢(shì)種。

2.2 韓式大醬與中式大醬中的真菌多樣性分析

擴(kuò)增大醬樣品中微生物的26S rRNA基因，并通過(guò)變性梯度凝膠電泳方法調(diào)查真菌的群落分布，韓式大醬PCR-DGGE結(jié)果如圖3所示，并對(duì)出現(xiàn)的每個(gè)條帶進(jìn)行堿基序列分析，鑒定結(jié)果如表3所示。

圖3 韓式大醬中26S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE fingerprints of 26S rRNA amplification products in Korean soybean paste

表3 韓式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測(cè)序結(jié)果Table 3 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Korean soybean paste

韓式大醬的真菌分布呈多樣性，根毛霉屬(Rhizomucor)、青霉菌屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、外瓶霉屬(Exophiala)、曲霉屬(Aspergillus)等分布廣泛。其中，曲霉屬通常能夠分泌較復(fù)雜酶系，如蛋白酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等，且具有較強(qiáng)的酶活性，能利用單糖、淀粉、低聚糖、酒精、有機(jī)酸等作為碳源，利用氨基酸、尿素、蛋白質(zhì)等作為氮源，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵[18];毛霉屬能產(chǎn)生果膠酶、凝乳酶和脂肪酶等，可用于制曲和釀酒[19]。因此，有必要對(duì)大醬的微生物多樣性進(jìn)行研究，了解大醬的微生物群落結(jié)構(gòu)，充分利用優(yōu)勢(shì)菌株。

中式大醬PCR-DGGE結(jié)果如圖4所示，并對(duì)出現(xiàn)的每個(gè)條帶進(jìn)行堿基序列分析，鑒定結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)分布較多，其次是熊蜂生斯塔莫酵母(Starmerellabombicola)但與韓式大醬相比，其真菌種類較為單一。

圖4 中式大醬中26S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE指紋圖譜Fig.4 DGGE fingerprints of 26S rRNA amplification products in Chinese soybean paste

魯氏接合酵母是豆醬發(fā)酵應(yīng)用相對(duì)較多的酵母菌，該菌具有較好的酒精發(fā)酵力，且耐鹽性極強(qiáng)、抗高滲透壓，在高鹽濃度下可發(fā)酵麥芽糖、葡萄糖產(chǎn)生甘露醇、甘油、乙醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、異戊醇、異丁醇等，此外還可以與乳酸菌代謝產(chǎn)物作用生成酯類物質(zhì)，產(chǎn)生大醬的特有香味。

近年來(lái)，Starmerella屬因其優(yōu)良的發(fā)酵特性引起了很多研究興趣[20]，Starmerellabombicola與Starmerellabacillaris是該屬的典型種[21-22]，TU等[23]分離鑒定出StarmerelladavenportiiDo18并進(jìn)行初步的發(fā)酵研究和發(fā)酵產(chǎn)物的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌能產(chǎn)生濃郁的香氣和有機(jī)酸，降低膽固醇，對(duì)高糖、低pH、膽鹽等各種抑制劑具有耐受性，并能模擬胃腸環(huán)境。

表4 中式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測(cè)序結(jié)果Table 4 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Chinese soybean paste

3 結(jié)論

韓式與中式大醬由于制作方法與水分含量的不同，其微生物的分布也不同。制作韓式大醬時(shí)，采用稻草捆綁醬曲進(jìn)行發(fā)酵，枯草芽孢桿菌可由稻草分離得到，因此韓式大醬中的芽孢桿菌屬較有優(yōu)勢(shì)，且制作過(guò)程中去除了醬油(醬鹵)，其水分含量低，適合霉菌生長(zhǎng)。此外，分離出的四聯(lián)球菌屬與嗜鹽單胞菌屬具有一定的耐鹽性，是豆制品發(fā)酵過(guò)程中常接種的微生物之一。

中式大醬的制作過(guò)程中未去除醬油，水分含量高，多為乳酸菌，如片球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬等，這些菌株可將氨基酸進(jìn)行異型脫羧基從而生成多類化合物，在大醬風(fēng)味形成過(guò)程中起到了重要作用。此外，魯氏接合酵母與熊蜂生斯塔莫酵母不僅具有一定的耐鹽性，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的醇類物質(zhì)還可與乳酸菌產(chǎn)生的酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)，從而賦予大醬獨(dú)特的醬香味。

本研究成功提取了大醬宏基因組DNA，并經(jīng)PCR擴(kuò)增靶基因后可較完整地反映相應(yīng)微生物群落組成，顯示出了菌群多樣性，從未培養(yǎng)角度證實(shí)了微生物在大醬發(fā)酵過(guò)程中具有重要地位。但PCR-DGGE只能分析在總微生物數(shù)量上占有一定優(yōu)勢(shì)的微生物，由于其分析的DNA片段較短，信息量較小，所以只能分析到一定范圍內(nèi)。綜上所述，DGGE可以作為分析豆醬中微生物組成的方法，對(duì)豆醬中微生物種類進(jìn)行估算，其精確分析則需要結(jié)合其他方法。此外，要了解微生物的生態(tài)功能，尤其是特殊菌種在大醬生產(chǎn)中的具體應(yīng)用，仍需要得到它們的純培養(yǎng)，因此傳統(tǒng)分離培養(yǎng)仍然是研究微生物多樣性不可缺少的手段。本研究對(duì)大醬的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探討，但對(duì)與之相對(duì)應(yīng)的功能還有待進(jìn)一步研究。