抗黑脛病菌煙草內(nèi)生真菌化學成分初步研究

馬 駿，王茂勝，黃 鴻，郭亞利，高 貴，王 霞，馬 瑩

(1.貴州省煙草公司黔西南州公司，貴州 興義 562400；2.貴州理工學院食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003； 3.甕福(集團)有限責任公司中低品位磷礦及其共伴生資源高效利用國家重點實驗室/甕福技術(shù)研究院，貴州 貴陽 550016； 4.貴州省煙草公司六盤水市公司，貴州 六盤水 553000)

0 引言

煙草是貴州省主要經(jīng)濟作物之一，是鄉(xiāng)村振興和財政收入的重要來源[1]。烤煙忌連作，由于土壤資源不足，連作經(jīng)常發(fā)生，導致煙草根莖性病害嚴重發(fā)生[2]，再加上長期化學肥料和農(nóng)藥的施用，降低煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，對煙農(nóng)收益造成很大的影響。因此，研究煙草土傳病害的生物防治顯得非常重要。植物內(nèi)生菌(Endophytic bacteria)最初由德國植物學家De Bary[3]在1866年提出，后經(jīng)過不斷完善和發(fā)展，認為內(nèi)生菌由一個多樣性十分豐富的微生物類群組成，分布于沒有外在感染癥狀的健康植物組織內(nèi)，并與宿主植物協(xié)同進化[4]，有時產(chǎn)生相同或相近的活性成分的生物功能[5]，如，相關(guān)報道有內(nèi)生菌有抗腫瘤[6]，抗黑脛病[7]等功能。

本文在前期對內(nèi)生真菌資源分離、鑒定、篩選等的基礎(chǔ)上，進一步采用氣質(zhì)聯(lián)用法，對活性內(nèi)生真菌(P.janthinellum)的化學成分進行初步研究，為煙草黑脛病的生物防治及下一步生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

內(nèi)生真菌菌株經(jīng)鑒定為P.janthinellum真菌，經(jīng)對煙草黑脛病拮抗篩選，具有拮抗活性。保存于貴州理工學院。

黑脛病菌株P(guān).parasitica來自貴州省煙草科學研究院。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂，配方見文獻[8]。

試劑：甲醇、乙酸乙酯及培養(yǎng)基用試劑均為分析純。

儀器： 安捷倫6890-5973 GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌絲體獲得及發(fā)酵液的制備

內(nèi)生真菌菌株經(jīng)活化后接入PDA培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h 。然后發(fā)酵液在10 000 r/min 下離心10 min，取菌絲體沉淀烘干備用；剩下部分為上清液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 揮發(fā)性成分的粗提取

菌絲體烘干后，粉碎，甲醇提取三次，合并濃縮備用。

上清液用3倍體積的乙酸乙酯萃取3次，每次6 h，然后合并有機相，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，得到揮發(fā)性成分乙酸乙酯的粗提物。于4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3 抗煙草黑脛病菌活性篩選

煙草內(nèi)生真菌菌絲體和煙草黑脛病菌采取直接對峙培養(yǎng)，先用打孔器把事先培養(yǎng)好的內(nèi)生真菌和黑脛病菌制成圓形菌碟，再把黑脛病菌碟培養(yǎng)在中心，接著把相同的2片內(nèi)生真菌置于兩旁對峙培養(yǎng)。25 ℃，5～7 d，觀察黑脛病菌生長和抑制情況。

菌絲體甲醇提取物和上清液的乙酸乙酯提取物的活性檢測方法一樣，培養(yǎng)時先把黑脛病菌碟培養(yǎng)在中心，再將事先制作好的過濾紙圓片，分別蘸取菌絲體甲醇提取液或上清液的乙酸乙酯提取液，放置在黑脛病菌的周圍進行對峙培養(yǎng)，25 ℃，5～7 d，觀察黑脛病菌生長和抑制情況。

1.2.4 樣品的檢測

樣品檢測方法參照文獻[9]，并根據(jù)實際情況作適當修改。氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)分析條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane (30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；柱溫為 50 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃/min 升溫至 280 ℃，后保持 2 min；氣化室溫度為 250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；載氣流量 1.0 mL/min；進樣量1 μL；分流比10∶1；離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量 70 eV；接口溫度為260 ℃；溶劑延遲 3 min；分子量范圍為50～550。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體與發(fā)酵液抗菌篩選

煙草內(nèi)生真菌對黑脛病的拮抗作用情況如圖1所示。圖1中，A為內(nèi)生真菌，B為菌絲體的甲醇提取物，C為上清液的乙酸乙酯提取物。由圖1可看出，通過對峙培養(yǎng)方法，對拮抗菌的發(fā)酵液進行抗菌追蹤，發(fā)現(xiàn)菌絲體對P.parasitica有拮抗作用；菌絲體甲醇提取物對P.parasitica有拮抗作用，而上清液乙酸乙酯提取物對P.parasitica的拮抗作用較弱。

圖1 煙草內(nèi)生真菌對黑脛病的拮抗作用

2.2 菌絲體甲醇提取物中化合物組成

采用GC-MS 方法分析煙草內(nèi)生真菌P.janthinellum菌絲體的甲醇提取物的化學成分，得出內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物中共有20種成分，其中脂類8種，包括鄰苯二甲酸二辛酯、丁內(nèi)酯、棕櫚酸甲酯、異硬脂酸甲酯、十八碳烯酸甲酯、十八碳二烯酸甲酯、酞酸二丁酯、十六碳酸酯，占40%；有機酸類9種，包括乙酸、尼克酸、十五烷酸、順-9-十六碳烯酸、十七烷酸、蓖麻油酸、十八(烷)酸、順-6-十八碳烯酸、亞油酸，占45%；酮類1種，二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮，占5%；其他2種，包括乙酰胺和環(huán)二十八烷，占10%。其中含量較高的三種物質(zhì)分別為十六碳酸酯、順-6-十八碳烯酸和亞油酸。相關(guān)情況分別如圖2和表1所示。

圖2 內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物質(zhì)譜圖

表1 內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物成分分析

由文獻檢索可知，菌絲體的甲醇提取物中十六碳酸和亞油酸含量較高，與制取抗菌素類藥氯霉素的前體物質(zhì)有關(guān)。崔君秀[10]指出十六碳酸酯是對小毛莨抗腫瘤有效部位的化學成分。王麗莎等[11]對澤漆的抗蟲、抗菌活性進行研究，發(fā)現(xiàn)各組分中含量較高的組分有十六碳酸酯和亞油酸。龔兵等[12]從一株苦檻藍內(nèi)生真菌Trichodermasp.09中尋找有抗植物病原菌活性的化合物，利用硅膠柱層析分離到6個化合物，其中就有十六碳酸酯。陳榮林報道[13]，蕎麥和苦蕎麥內(nèi)生真菌中抑菌抗腫瘤活性部位中含十六碳酸和亞油酸。李雅潔等[14]分析蒙山蜂膠揮發(fā)油組分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揮發(fā)油共鑒定出44種化合物，占色譜總餾出峰面積的93.12%，含量最高的組分為亞油酸23.91%，亞油酸用于合成第三代喹諾酮類抗菌藥洛美沙星的前體，亞油酸具有保健功能，如降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進微循環(huán)的作用，可預(yù)防或減少心血管病的發(fā)病率，特別是對高血壓、高血脂、心絞痛、冠心病、動脈粥樣硬化、老年性肥胖癥等的防治極為有利。結(jié)合本實驗結(jié)果，進一步確認十六碳酸和亞油酸這兩種物質(zhì)在菌絲體甲醇提取物中的含量很高，且具有抗黑脛病菌作用，推測菌絲體的甲醇提取物中抗菌物質(zhì)可能與十六碳酸和亞油酸有關(guān)，當然，對于活性物質(zhì)的研究和開發(fā)需要進一步研究和驗證。

由GC-MS 方法分析煙草內(nèi)生真菌P.janthinellum上清液乙酸乙酯提取物的化學成分，得出其化學成分有18種，其中脂類5種，丙酸乙酯、醋酸正丙酯、醋酸丁酯、丙酸丙酯、酞酸二丁酯，占28%；有機酸類7種，乙酸、丙醇酸、苯甲酸、苯乙酸、棕櫚酸、十八碳-6-烯酸、十八烷二烯酸，占39%；酮類1種為3-羥基-2-丁酮，占5.5 %；醇類2種，乙醇、丁二醇，占11%；醛類1種為十二烯醛，占5.5%；其他2種，包括3-乙基-2，5-甲基吡嗪和2-氧代乙酸乙酯肟，占11%。相關(guān)數(shù)據(jù)分別如圖3和表2所示。經(jīng)檢索，該組分中未發(fā)現(xiàn)有關(guān)抗病的組分及前體物質(zhì)。

圖3 內(nèi)生真菌液體上清液乙酸乙酯提取物質(zhì)譜圖

表2 內(nèi)生真菌液體上清液乙酸乙酯提取物成分分析

3 結(jié)語

本文采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)法對抗黑脛病的內(nèi)生真菌P.janthinellum的化學成分進行研究。結(jié)果顯示：內(nèi)生真菌菌絲體的甲醇提取物中共有20種成分，而液體發(fā)酵上清液的乙酸乙酯提取物中成分組成共有18種，而且成分也不同。

實驗結(jié)果表明，菌絲體的甲醇提取物比發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯的提取物的化學成分多2種。其中，菌絲體的甲醇提取物中十六碳酸和亞油酸含量較高，是制取抗菌素類藥氯霉素的前體物質(zhì)，推測可能具有抗菌或抗腫瘤活性。研究煙草內(nèi)生真菌抗P.parasitica活性物質(zhì)對于探索內(nèi)生真菌抗菌機理和生物農(nóng)藥的開發(fā)具有很好的前景。