基于HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同商品規(guī)格山慈菇質(zhì)量差異分析

郝壯壯，曹宇欣#，劉朦朦，薛靜文，張 鴿，蘆藝凡，范文昕，周 瑩，馮 靚，王春國(guó)，石晉麗

基于HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同商品規(guī)格山慈菇質(zhì)量差異分析

郝壯壯1，曹宇欣1#，劉朦朦1，薛靜文1，張 鴿1，蘆藝凡1，范文昕1，周 瑩3，馮 靚4，王春國(guó)2*，石晉麗1*

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 102488 3. 北京市朝陽(yáng)區(qū)高碑店社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100124 4. 北京市朝陽(yáng)區(qū)望京社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100102

建立山慈菇的HPLC指紋圖譜，對(duì)其特征成分進(jìn)行含量測(cè)定并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法分析不同商品規(guī)格山慈菇（冰球子、毛慈菇）化學(xué)成分的差異，為山慈菇藥材的質(zhì)量控制提供參考。優(yōu)化山慈菇藥材的提取方法，應(yīng)用HPLC法分別建立冰球子和毛慈菇指紋圖譜，并對(duì)特征成分進(jìn)行含量測(cè)定。采用相似度評(píng)價(jià)、聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principalcomponent analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）、Fisher線性判別分析（fisher linear discrimination analysis，F(xiàn)LDA）對(duì)特征成分進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。建立了冰球子和毛慈菇HPLC指紋圖譜，分別匹配了46個(gè)和43個(gè)共有峰，共標(biāo)示出17個(gè)色譜峰，指認(rèn)出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽8個(gè)色譜峰并同時(shí)建立了上述除天麻素以外7個(gè)成分的HPLC含量測(cè)定方法。CA與PCA結(jié)果可將2種不同商品規(guī)格山慈菇樣品明顯區(qū)分。OPLS-DA分析結(jié)合含量測(cè)定Fisher判別分析結(jié)果表明，2種不同商品規(guī)格的山慈菇樣品間存在顯著性差異的5種成分是loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽（＜0.001）。所建立的HPLC指紋圖譜結(jié)合CA、PCA、OPLS-DA分析及多成分含量測(cè)定能客觀、全面、有效地確定不同商品規(guī)格山慈菇中主要成分的差異，可為山慈菇質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的完善提供依據(jù)。

山慈菇；HPLC指紋圖譜；天麻素；loroglossin；dactylorhin A；白芨苷；山藥素III；白芨聯(lián)菲A；白芨聯(lián)菲B；卷瓣蘭蒽；化學(xué)計(jì)量學(xué)；質(zhì)量評(píng)價(jià)

山慈菇來(lái)源于蘭科植物杜鵑蘭(D. Don) Makino、獨(dú)蒜蘭(Franch.) Rolfe或云南獨(dú)蒜蘭Rolfe的干燥假鱗莖，前者習(xí)稱“毛慈菇”，后二者習(xí)稱“冰球子”[1]。具有清熱解毒、消癰散結(jié)[2]的功效?，F(xiàn)代研究表明，山慈菇主要含有糖苷類、菲類、聯(lián)芐類、多糖類及其他種類化學(xué)成分[3-10]，具有抗腫瘤[11]、抗菌[12]、抑制血管生成[13]和抗氧化[14]等藥理活性，常用于治療肝癌[15]、肺癌[16]和乳腺癌[17]等惡性腫瘤。其中糖苷類成分如天麻素[18]、白芨苷[19]等，菲類和聯(lián)芐類成分如山藥素III[20]、白芨聯(lián)菲A[21]等均具有良好的生物活性。

目前市場(chǎng)上山慈菇藥材質(zhì)量參差不齊，價(jià)格差異懸殊，分為“冰球子”和“毛慈菇”2種商品規(guī)格，二者分別來(lái)源于獨(dú)蒜蘭屬和杜鵑蘭屬，形態(tài)差異明顯，可能存在內(nèi)在成分差異?！氨蜃印钡膬r(jià)格常在1400～2800元/kg，而“毛慈菇”則在400～1600元/kg。《中國(guó)藥典》2020年版只包含性狀鑒別、顯微鑒別及檢查項(xiàng)，至今未見(jiàn)特征圖譜和含量測(cè)定項(xiàng)。近年來(lái)，有學(xué)者對(duì)山慈菇進(jìn)行了指紋圖譜研究并結(jié)合含量測(cè)定評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量[22-27]，如采用HPLC法建立了山慈菇藥材指紋圖譜，對(duì)dactylorhin A、白芨苷和秋水仙堿進(jìn)行了含量測(cè)定。但目前已建立的山慈菇指紋圖譜僅針對(duì)單一商品規(guī)格或藥材基原不明確，對(duì)不同商品規(guī)格山慈菇之間的內(nèi)在成分差異研究未見(jiàn)報(bào)道；分離峰的數(shù)目較少，指認(rèn)出的特征峰不夠全面。且僅以少數(shù)成分作為山慈菇含量測(cè)定指標(biāo)，較難客觀全面地評(píng)價(jià)其質(zhì)量，山慈菇質(zhì)量評(píng)價(jià)研究總體不夠深入。

本研究以冰球子和毛慈菇2種商品規(guī)格的山慈菇樣品為研究對(duì)象，收集了多個(gè)主要產(chǎn)地的多批冰球子和毛慈菇樣本，擬建立不同商品規(guī)格山慈菇藥材的HPLC指紋圖譜?；谇捌谫|(zhì)譜研究鎖定了多類化學(xué)成分（糖苷類、2-異丁基蘋(píng)果酸酯類、2-異丁基酒石酸酯類、聯(lián)芐類、菲類）中的代表成分，擬同時(shí)對(duì)多種成分進(jìn)行定量分析，并結(jié)合聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，篩選不同商品規(guī)格山慈菇藥材的差異成分，從化學(xué)成分的角度闡明兩者的質(zhì)量特征，以期為山慈菇藥材質(zhì)量控制體系的完善提供依據(jù)，為挖掘潛在的山慈菇質(zhì)量標(biāo)志物提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

對(duì)照品天麻素（批號(hào)A0138）、dactylorhin A（批號(hào)A1379）、白芨苷（批號(hào)A1378）、山藥素III（批號(hào)A1260）、白芨聯(lián)菲A（批號(hào)A1267）、白芨聯(lián)菲B（批號(hào)A1299）、卷瓣蘭蒽（批號(hào)A1301）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；loroglossin（批號(hào)PCS55129）購(gòu)自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司。所用對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；乙腈（色譜純，美國(guó)飛世爾試劑公司），娃哈哈純凈水，其余均為分析純。

26批山慈菇樣品分別取自于貴州、云南、四川、廣西各地，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)科石晉麗教授鑒定為蘭科植物杜鵑蘭(D. Don) Makino、獨(dú)蒜蘭(Franch.) Rolfe和云南獨(dú)蒜蘭Rolfe的干燥假鱗莖。

表1 26批山慈菇樣品來(lái)源信息

1.2 儀器

島津LC-20A型高效液相（日本島津公司）；Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（美國(guó)安捷倫公司）；ME155DU型精密電子天平（十萬(wàn)分之一，美國(guó)梅特勒-托利多公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；600Y型高速多功能粉碎機(jī)（浙江西廚有限公司）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康儀器有限公司），RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法考察

2.1.1 超聲提取 精密稱取山慈菇樣品MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量70%乙醇，超聲（功率1000 W、頻率40 Hz）處理60 min，連續(xù)超聲2次，靜置，濾過(guò)，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機(jī)中干燥至恒定質(zhì)量，得山慈菇70%乙醇超聲提取物干膏（C1～C3）。

2.1.2 回流提取 精密稱取山慈菇樣品MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入10倍量70%乙醇加熱回流提取，每次60 min，連續(xù)提取2次，靜置，濾過(guò)，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機(jī)中干燥至恒定質(zhì)量，得山慈菇70%乙醇回流提取物干膏（H1～H3）。

2.1.3 超聲聯(lián)合回流提取 精密稱取山慈菇樣品 MCG-1粉末（60目篩）2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量70%乙醇，超聲（功率1 000 W、頻率40 Hz）處理60 min，靜置，濾過(guò)，殘?jiān)儆?0倍量70%乙醇加熱回流提取60 min，靜置，濾過(guò)，合并濾液。減壓濃縮后，于冷凍干燥機(jī)中干燥至恒定質(zhì)量，得山慈菇70%乙醇超聲聯(lián)合回流提取物干膏（CH1～CH3）。

參考楊紅燕等[24]在HPLC指紋圖譜中應(yīng)用的提取方法，考察不同提取方式對(duì)山慈菇藥材提取率的影響。單因素方差分析結(jié)果表明回流提取和超聲結(jié)合回流提取明顯優(yōu)于超聲提?。ǎ?.05），但回流提取和超聲結(jié)合回流提取沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05），故選擇回流提取為山慈菇提取方式，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品不同提取方式下提取率比較

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B）；梯度洗脫條件：0～4 min，5% A；4～5 min，5%～20% A；5～35 min，20%～33% A；35～70 min，33%～52% A；70～72 min，52%～95% A；72～80 min，95% A；進(jìn)樣體積10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.3 提取條件優(yōu)化

取山慈菇樣品MCG-1 9份，每份2 g，設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）及提取次數(shù)（D）為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，如表3所示。采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，提取方法同“2.1.3”項(xiàng)下內(nèi)容。

表3 正交試驗(yàn)因素與水平

取各試驗(yàn)所得干膏適量，精密稱定，配制成20 mg/mL溶液按按“2.2”項(xiàng)進(jìn)行HPLC測(cè)定，以樣品提取率、HPLC色譜圖總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)極差分析得出對(duì)2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響因素排序分別為A＞B＞D＞C、A＞D＞B＞C，最佳設(shè)計(jì)分別為A1B3C2D3、A3B1C3D1，結(jié)合雙指標(biāo)綜合平衡法得到最佳提取條件為70%乙醇回流提取2次，每次90 min，料液比為1∶20，結(jié)果如表4、5。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(提取率)

表5 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果(總峰面積)

2.4 溶液的制備

2.4.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取對(duì)照品天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽適量，加入60%乙腈配制成質(zhì)量濃度分別12.40、3.13、8.00、55.56、1.10、16.67、16.67、16.67 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，保存于4 ℃冰箱備用。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取山慈菇各樣品粉末（60目篩）適量，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入20倍量70%乙醇加熱回流提取90 min，連續(xù)提取2次，靜置，濾過(guò)，合并濾液，于10 mL量瓶中定容，配成160 mg/mL（以生藥量計(jì)）溶液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，備用。

2.5 毛慈菇與冰球子樣品HPLC指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間與峰面積。結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間的RSD＜0.8%，各共有峰峰面積的RSD＜1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，平行進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間與峰面積，結(jié)果表明各共有峰保留時(shí)間的RSD＜0.35%，各共有峰峰面積的RSD＜1.93%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)分析，計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果各共有峰的保留時(shí)間的RSD＜0.36%，各共有峰的峰面積的RSD＜1.9%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 分別稱取26批山慈菇樣品適量，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備成山慈菇供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析。將所得的樣品數(shù)據(jù)全譜按不同商品規(guī)格分別導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件中，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗口設(shè)定為0.1 min，分別選取BQZ-1和MCG-1作為參照?qǐng)D譜，建立各個(gè)商品規(guī)格山慈菇的指紋圖譜，得到冰球子14批樣品指紋圖譜疊加圖、毛慈菇12批樣品指紋圖譜疊加圖及對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖1、2。其中冰球子匹配了46個(gè)共有峰，毛慈菇匹配了43個(gè)共有峰，經(jīng)與混合對(duì)照品的HPLC圖進(jìn)行比較，共指認(rèn)出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽8個(gè)色譜峰，通過(guò)與前期質(zhì)譜研究和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[25-26]比對(duì)可確定蘋(píng)果酸、手參苷、手參苷II、1,4-di(4-β--glucopyrano- syloxybenzyl)-2-benzylmalate diester、shancigusin H、手參苷V、手參苷VI、手參苷IV、手參苷V異構(gòu)體共9個(gè)色譜峰。

圖1 14批次冰球子和12批次毛慈菇HPLC指紋圖譜

1-蘋(píng)果酸 2-天麻素 3-loroglossin 4-dactylorhin A 5-手參苷 6-手參苷II 7-白芨苷 8-1,4-di(4-β-D-glucopyranosyl- oxybenzyl)-2-benzylmalate diester 9-shancigusin H 10-手參苷Ⅴ 11-手參苷VI 12-手參苷IV 13-手參苷V 異構(gòu)體 14-山藥素III 15-白芨聯(lián)菲A 16-白芨聯(lián)菲B 17-卷瓣蘭蒽

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，以各商品規(guī)格山慈菇對(duì)照指紋圖譜作為參照?qǐng)D譜，設(shè)其相似度為1.000，計(jì)算各個(gè)商品規(guī)格山慈菇的相似度，見(jiàn)表6。14批冰球子指紋圖譜相似度為0.986～0.997，12批毛慈菇指紋圖譜相似度為0.974～0.997。其中“毛慈菇”只有杜鵑蘭一種基原，表明該基原所含化學(xué)成分一致性較好，而“冰球子”規(guī)格下包括獨(dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭2種基原，但其化學(xué)一致性仍然較好，可能是因?yàn)楠?dú)蒜蘭和云南獨(dú)蒜蘭屬于同屬植物，表明獨(dú)蒜蘭屬內(nèi)化學(xué)成分差異較小。

2.6 冰球子和毛慈菇的化學(xué)模式識(shí)別

2.6.1 聚類分析（cluster analysis，CA） 將2種不同商品規(guī)格的26批山慈菇樣品中16個(gè)特征峰（峰2～17）的峰面積為變量（缺失色譜峰峰面積以0計(jì)），導(dǎo)入SPSS 21.0軟件，采用組間聯(lián)接和平方Euclidean距離作為分類依據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，探討不同商品規(guī)格山慈菇樣品成分含量的一致性，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)刻度距離為25時(shí)，26批山慈菇樣品聚為2類：MCG-1～MCG-12號(hào)樣品聚為第1類，BQZ-1～BQZ-14號(hào)樣品聚為第2類，表明毛慈菇和冰球子化學(xué)成分的含量有明顯差異，HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類分析可以初步區(qū)分這2種商品規(guī)格的山慈菇樣品，但不同產(chǎn)地間區(qū)分不明顯。

表6 山慈菇樣品HPLC指紋圖譜相似度結(jié)果

圖3 不同商品規(guī)格山慈菇CA分析樹(shù)狀圖

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA得分散點(diǎn)圖可以直觀顯示出不同樣品之間的整體差異性，反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，觀察到試驗(yàn)樣品的自然分布和組別關(guān)系。采用SIMCA 14.1軟件，對(duì)山慈菇樣品中16個(gè)特征峰峰面積進(jìn)行PCA分析，通過(guò)得分圖上樣品的聚散程度觀察不同商品規(guī)格樣品間的差異性趨勢(shì)。山慈菇樣品的Scores圖和Loading圖如圖4所示。建立的模型累計(jì)模型解釋率2cum為0.986，累計(jì)模型預(yù)測(cè)能力為0.796，表明建立的模型可以解釋98.6%的原始信息，且2cum和2cum均大于0.5，表明建立的模型良好，穩(wěn)定可靠。由Scores圖可知，2種商品規(guī)格藥材分別聚集在2個(gè)不同的區(qū)域，說(shuō)明兩者化學(xué)成分存在較大差異，可以得到較好地區(qū)分，與聚類結(jié)果基本一致。Loading圖中成分點(diǎn)距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)表明該成分對(duì)樣品的差異性貢獻(xiàn)越大，通過(guò)Loading圖可知，對(duì)p[1]（軸）的影響順序由大到小依次為峰4、11、8；對(duì)p[2]（軸）的影響順序由大到小依次為峰14、15、5。

2.6.3 正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 不同于PCA，OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，該方法基于OPLS，使分類信息主要集中在主成分上，建立樣品類別之間的關(guān)系模型，并且使模型易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯。為進(jìn)一步篩選對(duì)不同商品規(guī)格山慈菇藥材質(zhì)量影響較大的成分，在PCA基礎(chǔ)上將其分為2組，以冰球子和毛慈菇指紋圖譜的16個(gè)特征峰峰面積為變量，利用SIMCA14.1軟件建立OPLS-DA模型。在OPLS-DA得分圖（2cum為0.69，2cum為0.973，2cum為0.966）中，14批冰球子及12批毛慈菇可很好地區(qū)分為2類，且相較與PCA區(qū)分度更大，如圖5-a所示，其中BQZ-8、9、10略微離群，可能是產(chǎn)地因素導(dǎo)致。生成的VIP圖如圖5-b所示。以變量重要性投影值（VIP）＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出10個(gè)差異性標(biāo)志物，為峰4、8、3、11、7、10、12、17、13、16，分別為dactylorhin A、1,4-di(4-β--glucopyranosyl-oxybenzyl)-2-benzyl- malate diester、loroglossin、手參苷VI、白芨苷、手參苷V、手參苷IV、卷瓣蘭蒽、手參苷V 異構(gòu)體、白芨聯(lián)菲B，其中dactylorhin A的VIP值最大，說(shuō)明毛慈菇和冰球子中dactylorhin A的含量差異最顯著。為防止模型出現(xiàn)過(guò)擬合，通過(guò)置換檢驗(yàn)200次對(duì)模型內(nèi)部進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖5-c，2、2回歸線的截距分別為0.114、?0.51，均小于原始值，證明模型穩(wěn)定可靠，可用于2種商品規(guī)格山慈菇樣品的分析。

圖4 26批山慈菇PCA (a) 及16種成分PCA載荷圖(b)

圖5 26批山慈菇OPLS-DA得分圖(a)、16個(gè)成分VIP圖(b) 及OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)結(jié)果(c)

2.7 山慈菇中7種特征成分的HPLC含量測(cè)定

山慈菇的化學(xué)成分研究較少，目前認(rèn)為其有效成分主要為菲類、聯(lián)芐類以及2-異丁基蘋(píng)果酸酯類成分。根據(jù)前期質(zhì)譜研究結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[25-26]分析，發(fā)現(xiàn)其含量較高的成分主要是2-異丁基蘋(píng)果酸酯類成分如 dactylorhin A、白芨苷、gymnoside等，2-異丁基酒石酸酯類成分如loroglossin、2-芐基蘋(píng)果酸酯類成分如1,4-di(4-β--glucopyranosyl- oxybenzyl) 2- benzylmalate diester等，以及菲類成分如白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽等，聯(lián)芐類成分如山藥素III等，且冰球子與毛慈菇上述成分含量差異較為明顯。本研究為比較山慈菇2種商品規(guī)格的化學(xué)成分差異，完善山慈菇藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，根據(jù)其指紋圖譜中的化學(xué)成分特征以及可行性，選取loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽7個(gè)代表性成分建立含量測(cè)定方法。

2.7.1 線性關(guān)系考察 精密吸取loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按倍比稀釋的方法稀釋成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)（2），同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)限（/＝3）和定量限（/＝10）的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7，各成分在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

2.7.2 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別計(jì)算各待測(cè)峰的保留時(shí)間與峰面積。結(jié)果表明各待測(cè)峰保留時(shí)間的RSD＜0.05%，峰面積的RSD＜2.5%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，分別計(jì)算各待測(cè)峰的保留時(shí)間與峰面積，結(jié)果表明各待測(cè)峰保留時(shí)間的RSD＜0.1%，峰面積的RSD＜2.43%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)分析，計(jì)算各待測(cè)峰的保留時(shí)間及峰面積。結(jié)果各待測(cè)峰的保留時(shí)間的RSD＜0.3%，峰面積的RSD＜3.0%。表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 取編號(hào)為BQZ-1和MCG-1的山慈菇樣品各6份，每份0.4 g，以近1∶1的比例加入相應(yīng)化學(xué)成分的對(duì)照品，于5 mL量瓶中用60%乙腈定容，配制成80 mg/g（以生藥量計(jì)）的溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，分別記錄各成分峰的保留時(shí)間與峰面積，計(jì)算各成分的加標(biāo)回收率和RSD值。冰球子和毛慈菇的各待測(cè)成分平均加樣回收率分別為99.20%～103.15%和98.43%～102.25%，RSD分別為0.57%～1.64%和0.52%～1.73%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.7.6 樣品測(cè)定 取14批冰球子樣品和12批毛慈菇樣品，按“2.4.2”項(xiàng)下條件制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)分析，根據(jù)各成分最適宜檢測(cè)波長(zhǎng)，分別在230 nm（loroglossin）、220 nm（dactylorhin A）、224 nm（白芨苷）、270 nm（山藥素III、白芨聯(lián)菲A）、320 nm（白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽）下進(jìn)行檢測(cè)，得到待測(cè)成分峰面積，計(jì)算樣品含量，見(jiàn)表8。根據(jù)各指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果柱形圖可以明確不同商品規(guī)格山慈菇中差異性指標(biāo)成分，見(jiàn)圖6。

2.7.7 Fisher線性判別（fisher linear discrimination analysis，F(xiàn)LDA） 利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件的Fisher線性判別分析驗(yàn)證OPLS-DA中VIP大于1.0的5個(gè)指標(biāo)成分作為不同商品規(guī)格山慈菇識(shí)別的適用性，將BQZ-1、5、8、11及MCG-1、4、7、10號(hào)樣品設(shè)為驗(yàn)證集，其余樣品均為訓(xùn)練集。將訓(xùn)練集樣本按照商品規(guī)格進(jìn)行分組建模，以loroglossin（a）、dactylorhin A（b）、白芨苷（c）、白芨聯(lián)菲B（f）、卷瓣蘭蒽（g）作為判別變量，建立判別函數(shù)（discriminant function，DF），DFBQZ＝?43.839＋0.030a＋0.029b＋0.003c＋0.758f?2.545g，DFMCG＝?53.319＋0.153a＋0.007b＋1.959f?6.595g，組質(zhì)心處的函數(shù)分別為?5.268、5.926，且判別函數(shù)的Lambda檢驗(yàn)顯著性均小于0.05。由訓(xùn)練集樣本自身驗(yàn)證及驗(yàn)證集驗(yàn)證，樣本總正確判別率均為100%。表明loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽可以作為山慈菇商品規(guī)格區(qū)分的指標(biāo)成分。

表8 26批山慈菇樣品含量測(cè)定

A-loroglossin B-dactylorhin A C-白芨苷 D-山藥素III E-白芨聯(lián)菲A F-白芨聯(lián)菲B G-卷瓣蘭蒽 ***P＜0.001

3 討論

3.1 提取方法考察及提取條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了提取方法（超聲提取、回流提取、超聲結(jié)合回流提?。?duì)山慈菇藥材提取率的影響，并基于正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了提取條件（乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)）。文獻(xiàn)中山慈菇藥材的提取常采用甲醇超聲法[25]。本研究前期比較相同比例的甲醇-水、乙醇-水超聲提取，發(fā)現(xiàn)二者并無(wú)明顯差異，考慮到山慈菇藥材主要的有效成分類型為菲類、聯(lián)芐類及異丁基蘋(píng)果酸酯類成分等，而乙醇的極性較甲醇小，對(duì)有效成分的提取可能更為完全，且乙醇較甲醇毒性小，故選擇乙醇-水作為提取溶劑進(jìn)行下一步的考察。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)雙指標(biāo)綜合平衡法，基于提取率和總峰面積2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行極差分析。以提取率為指標(biāo)評(píng)價(jià)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)指標(biāo)的差異貢獻(xiàn)最高，其次是料液比、回流次數(shù)、回流時(shí)間，其中在60%乙醇、1∶30、60 min、3次條件下提取率最高。以總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)指標(biāo)的差異貢獻(xiàn)最高，其次是回流次數(shù)、料液比、回流時(shí)間，其中在80%乙醇、1∶10、90 min、1次條件下總峰面積最大。綜合各因素各水平對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的差異貢獻(xiàn)，最終確定最佳提取條件為：70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20、回流提取2次，每次90 min。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究前期基于楊紅燕等[24]研究對(duì)HPLC洗脫梯度、柱溫、流速進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)HPLC指認(rèn)出天麻素、loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、山藥素III、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽等山慈菇中含量較高的代表性成分，并采用PDA檢測(cè)器對(duì)山慈菇供試品溶液進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，各類成分在190～210 nm吸收均較高，綜合基線、峰形及分離度等因素，選取200 nm作為HPLC指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)，并選擇230 nm（loroglossin）、220 nm（dactylorhin A）、224 nm（白芨苷）、270 nm（山藥素III、卷瓣蘭蒽）、320 nm（白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B）作為含量測(cè)定的專屬檢測(cè)波長(zhǎng)，最大程度地減少對(duì)成分含量測(cè)定的影響。

3.3 指紋圖譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

本研究采用相似度評(píng)價(jià)、CA、PCA和OPLS-DA等方法對(duì)多批次不同商品規(guī)格山慈菇藥材指紋圖譜進(jìn)行全面、客觀的評(píng)價(jià)，成功區(qū)分了冰球子和毛慈菇并挖掘出二者的差異性成分；利用Fisher線性判別分析驗(yàn)證所選的特征成分作為不同商品規(guī)格山慈菇識(shí)別指標(biāo)的適用性，為山慈菇藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇提供了依據(jù)。2個(gè)商品規(guī)格內(nèi)部指紋圖譜的相似度均大于0.9，但不同商品規(guī)格間相似度有所區(qū)別，表明不同商品規(guī)格藥材間化學(xué)成分存在一定的差異?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果也可將兩者明顯區(qū)分，其中BQZ-8、BQZ-9、BQZ-10在PCA和OPLS-DA中略有離群，可能是由于這3個(gè)產(chǎn)于云南麗江的樣品中白芨苷、山藥素III含量較其他產(chǎn)地更高，這種含量差異可能與藥材生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間等有關(guān)。最后從標(biāo)示出的16個(gè)特征峰中以O(shè)PLS-DA模型的VIP值大于1進(jìn)行2種商品規(guī)格的差異成分篩選，得到了dactylorhin A、1,4-di(4-β--glucopyrano- syloxybenzyl)-2-benzylmalate diester、loroglossin、手參苷VI、白芨苷、手參苷V、手參苷IV、卷瓣蘭蒽、手參苷V 異構(gòu)體、白芨聯(lián)菲B10個(gè)成分。該結(jié)果與PCA載荷圖基本一致，說(shuō)明這些成分可能是不同商品規(guī)格山慈菇藥材中的差異性指標(biāo)成分。

3.4 多成分含量測(cè)定

迄今為止，山慈菇的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分暫不明確，質(zhì)量評(píng)價(jià)體系尚未完善。因此尋找山慈菇藥材中差異性成分并建立相應(yīng)的含量測(cè)定方法對(duì)山慈菇質(zhì)量控制具有非常重要的意義。

本研究收集了山慈菇4個(gè)主要產(chǎn)地的26批樣品，以不同商品規(guī)格分類，選取7個(gè)特征性成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白芨苷含量符合正態(tài)分布，方差齊，故采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，具有極顯著性差異（＜0.001）；loroglossin、山藥素III含量符合正態(tài)分布，方差不齊，采用單樣本檢驗(yàn)，loroglossin具有極顯著性差異（＜0.001），山藥素III有差異趨勢(shì)，但無(wú)顯著性（＞0.05）；dactylorhin A、白芨聯(lián)菲A、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U），結(jié)果其均具有極顯著性差異（＜0.001）。通過(guò)Fisher線性判別分析，分別構(gòu)建了冰球子和毛慈菇的判別函數(shù)，由訓(xùn)練集樣本自身驗(yàn)證及驗(yàn)證集驗(yàn)證，樣本總正確判別率為100%。說(shuō)明所選的5種有效成分可作為指標(biāo)成分用于鑒別兩種不同商品規(guī)格山慈菇樣品，為山慈菇真?zhèn)舞b別提供了參考。

另外，峰1-蘋(píng)果酸和峰2-天麻素作為山慈菇中異丁基蘋(píng)果酸酯類成分的結(jié)構(gòu)單元，也具有一定的研究?jī)r(jià)值，但是二者極性較大，出峰過(guò)早，容易受到溶劑效應(yīng)的影響，較難在C18柱中對(duì)其他小極性特征成分定量的同時(shí)兼顧，更好的定量方法有待研究。本研究建立了不同商品規(guī)格山慈菇藥材的HPLC指紋圖譜，指認(rèn)出山慈菇中17種特征成分峰，并基于除蘋(píng)果酸以外的16種特征成分的峰面積通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析成功區(qū)分了2種不同商品規(guī)格的山慈菇樣品，通過(guò)OPLS-DA模型VIP值篩選出了10個(gè)差異性標(biāo)志物；建立了同時(shí)測(cè)定7種特征成分的含量測(cè)定方法，并結(jié)合VIP值最終篩選出5種含量具有極顯著差異的差異性標(biāo)志物（loroglossin、dactylorhin A、白芨苷、白芨聯(lián)菲B、卷瓣蘭蒽），對(duì)冰球子與毛慈菇的化學(xué)成分差異做出了較為全面的分析。結(jié)果表明兩者在成分的種類和含量上存在明顯的差異。該研究可為不同商品規(guī)格山慈菇藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考，為山慈菇藥材整體質(zhì)量控制體系的完善提供數(shù)據(jù)支撐。然而，本研究還存在一些不足：第一，主要探究了不同商品規(guī)格藥材間的差異性，但從化學(xué)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地樣品間也存在一定差異，但本實(shí)驗(yàn)各產(chǎn)地樣品批次較少，接下來(lái)可收集更多批次不同產(chǎn)地的樣品，考察產(chǎn)地因素對(duì)其化學(xué)成分的影響。第二，手參苷類成分在山慈菇中含量較高，是山慈菇中比較重要的一類化學(xué)成分，但由于其對(duì)照品不易獲得，無(wú)法對(duì)此類化學(xué)成分進(jìn)行定量分析，后期可通過(guò)分離純化制備此類成分單體，進(jìn)行深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality differences of different commercial specifications ofbased on HPLC fingerprint, multi-index component determination and chemometrics

HAO Zhuang-zhuang1, CAO Yu-xin1, LIU Meng-meng1, XUE Jing-wen1, ZHANG Ge1, LU Yi-fan1, FAN Wen-xin1, ZHOU ying3, FENG Liang4, WANG Chun-guo2, SHI Jin-li1

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 2. Research Institute of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China 3. Gaobeidian Community Health Service Center, Chaoyang District, Beijing 100124, China 4. Wangjing Community Health Service Center, Chaoyang District, Beijing 100102, China

To establish the HPLC fingerprint of(Shancigu), determine the content of its characteristic components, and analyze the difference of the chemical components of the different commercial specifications (BingqiuziandMaocigu) of Shancigu combined with a variety of chemometrics analyses to provide a reference for its quality control.The extraction method of Shancigu was optimized. HPLC was used to establish the fingerprint of BingqiuziandMaocigu respectively, and the content of characteristic components was determined. The data of characteristic components were analyzed by similarity evaluation, cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA), orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) and Fisher linear discriminant analysis (FLDA).HPLC fingerprints of Bingqiuzi and Maocigu were established, and a total of 46 and 43 common peaks were matched in Bingqiuzi and Maocigu respectively, 17 chromatographic peaks were calibrated, and eight chromatographic peaks were identified, including gastrodin, loroglossin, dactylorhin A, militarine, batatasin III, blestriarene A, blestriarene B, monbarbatain A, and HPLC method for the determination of the above seven components except gastrodin was established simultaneously. The results of CA and PCA can distinguish two kinds of samples of different commercial specifications. The results of OPLS-DA analysis combined with content determination Fisher discriminant analysis showed that loroglossin, dactylorhin A, militarine, blestriarene B, and monbarbatain A (< 0.001) were the components with significant differences between the samples of two different commodity specifications.The HPLC fingerprint of Shancigu combined with CA, PCA, OPLS-DA analysis and multi-component content determination, can determine the differences of the main components in different commercial specifications of Shancigu objectively, comprehensively and effectively, and provide a basis for the improvement of the quality evaluation system of Shancigu.

(shancigu); HPLC fingerprint; gastrodin; loroglossin; dactylorhin A; militarine; batatasin III; blestriarene A; blestriarene B; monbarbatain A; chemometrics; quality evaluation

R286.2

A

0253 - 2670(2023)06 - 1935 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.026

2022-07-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82073971）

郝壯壯，男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail: bucmhzz@126.com

王春國(guó)，實(shí)驗(yàn)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: wangcg1119@126.com

石晉麗，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。E-mail: shijl@vip.sina.com

#共同第一作者：曹宇欣，女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制。E-mail: 18835196398@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]