基于物理指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量測定構(gòu)建升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量評價方法

楊 婉，鄒海英，邱智東，楊 晶，陳 新

基于物理指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量測定構(gòu)建升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量評價方法

楊 婉，鄒海英，邱智東，楊 晶*，陳 新*

長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省長白山道地藥材藥效物質(zhì)重點(diǎn)研究室，吉林 長春 130117

建立升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理指紋圖譜及6種指標(biāo)成分（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、芒果苷、異阿魏酸）含量測定方法，為其質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。基于遵古理念制備15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液，以溶解性固體總量、pH值、密度、動力黏度、電導(dǎo)率、表面張力、折光率及固含量8個物理參數(shù)構(gòu)建升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋圖譜；采用相似度評價、主成分分析（principal component analysis，PCA）及層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）對物理指紋圖譜進(jìn)行評價及異常樣品判斷。以HPLC法測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、芒果苷、異阿魏酸6種指標(biāo)成分含量，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法進(jìn)行分析。15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理指紋圖譜存在差異，主要體現(xiàn)在溶解性固體總量、動力黏度及電導(dǎo)率3個指標(biāo)上；相似度分析與PCA結(jié)果顯示，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液相似度均大于0.9，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液聚為2類，A1、A2、A3、A8、A12、A13、A15聚為一類，其余標(biāo)準(zhǔn)煎液聚為一類。由DMod控制圖監(jiān)測顯示，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液均為正常樣品；15批標(biāo)準(zhǔn)煎液中6種指標(biāo)成分質(zhì)量濃度分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷4.81～6.30 μg/mL、刺芒柄花苷1.50～1.78 μg/mL、毛蕊異黃酮3.50～4.65 μg/mL、芒柄花黃素1.33～1.63 μg/mL、芒果苷68.33～75.23 μg/mL、異阿魏酸3.50～5.65 μg/mL，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液指標(biāo)成分含量HCA結(jié)果與物理指紋圖譜HCA結(jié)果一致。構(gòu)建的升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋圖譜與指標(biāo)成分含量測定方法，可用于其一致性評價、質(zhì)量控制及其煎煮全過程的動態(tài)監(jiān)控。

升陷湯；標(biāo)準(zhǔn)煎液；物理指紋圖譜；質(zhì)量評價；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；刺芒柄花苷；毛蕊異黃酮；芒柄花黃素；芒果苷；異阿魏酸；主成分分析

中藥主要含有多糖、皂苷類、黃酮類、醌類、生物堿、蛋白質(zhì)及黏液質(zhì)等化學(xué)成分，其中，多糖、皂苷類、生物堿鹽、蛋白質(zhì)及黏液質(zhì)等成分易溶于水，在煎煮過程中，由于溶出的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類型、分子大小及形態(tài)不同等原因，故中藥水煎液中存在小分子、生物大分子以及無機(jī)鹽等，形成復(fù)雜的溶液體系[1]。水煎液是一種混懸液，其中存在大量形態(tài)和大小不同的微米級、納米級顆粒體，導(dǎo)致水煎液質(zhì)量存在一定的差異[2-3]。目前，中藥水煎液多從化學(xué)角度以指紋圖譜、含量測定等方法進(jìn)行研究，缺乏全面、綜合的質(zhì)量評價方法。中藥物理指紋圖譜已用于中藥粉體學(xué)的研究，主要集中在中藥破壁粉、中藥浸膏粉、中藥顆粒、藥用輔料、制劑成型全過程質(zhì)量評價及制劑處方設(shè)計中的應(yīng)用[4]，在中藥注射液的質(zhì)量評價研究中也有所應(yīng)用[5]。

升陷湯的有效部位主要為皂苷類和黃酮類，前期課題組已完成升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液皂苷類成分HPLC-ELSD特征指紋圖譜建立及3種皂苷類成分的含量測定[6]。因此，本研究根據(jù)中藥水煎液體系的流變學(xué)、表面化學(xué)、電化學(xué)等物理化學(xué)特性[7]，選擇溶解性固體總量（total dissolved solids，TDS）、pH值、密度（）、動力黏度（）、電導(dǎo)率（）、表面張力（）、折光率（）及固含量（solid content，SC）8個參數(shù)構(gòu)建物理指紋圖譜；以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、芒果苷、異阿魏酸6種指標(biāo)成分進(jìn)行化學(xué)表征，以期建立真正反映中藥水煎液的內(nèi)在、綜合的質(zhì)量及其一致性的評價方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB135-S型十萬分之一分析天平，上海天美天平儀器有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)式黏度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；WYA-2WAJ型數(shù)字顯示折光儀，力辰科技有限公司；DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MC-1021型表面張力儀，閩測儀器設(shè)備有限公司；Agilent 1260 Series型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.2 藥品與試劑

對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.8%，批號111920-201907）、芒果苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.1%，批號111607-201704）、異阿魏酸（質(zhì)量分 數(shù)≥99.3%，批號111698-201904），中國食品藥品檢定研究院；對照品刺芒柄花苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.48%，批號MUST-22080317）、芒柄花黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.03%，批號MUST-22033005），成都曼思特生物科技有限公司；對照品毛蕊異黃酮（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號ST08810120），上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)公司；乙腈，色譜純，美國Fisher公司；甲醇，北京化工廠；水為屈臣氏蒸餾水。

升陷湯中5味藥材均各收集15個批次，且每味藥材飲片來源于3個產(chǎn)地，每個產(chǎn)地收集5個批次，產(chǎn)地信息見表1。藥材黃芪、柴胡、升麻、知母、桔梗均經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院肖井雷教授鑒定，分別為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao的干燥根、傘形科植物柴胡DC.的干燥根、毛茛科植物興安升麻(Turcz.) Maxim.的干燥根莖、百合科植物知母Bge.的干燥根莖、桔?？浦参锝酃?Jacq.) A. DC.的干燥根。各味中藥均符合《中國藥典》2020年版的規(guī)定品種。

2 方法與結(jié)果

2.1 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的制備

取黃芪飲片22.4 g、柴胡飲片5.6 g、升麻飲片3.7 g、桔梗飲片5.6 g，加水10倍量，浸泡30 min，煎煮15 min至沸，下入知母飲片11.2 g，繼續(xù)煎煮10 min，濾過，藥渣加水8倍量，煎煮15 min，濾過，濾液合并加水調(diào)整體積至600 mL，即得升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液。按照上述方法制備15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液，編號為A1～A15。飲片混批信息見表2。

2.2 構(gòu)建物理指紋圖譜

2.2.1 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)的測定 參考《中國藥典》2020年版四部通則及文獻(xiàn)報道[8-10]，對升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)TDS、pH值、、、、、及固含量進(jìn)行測定，并構(gòu)建升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋圖譜。具體檢測方法如下。

表1 15批升陷湯各藥味飲片產(chǎn)地信息

表2 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液樣品的飲片混批樣品信息

（1）TDS：采用電導(dǎo)率儀進(jìn)行測定，測定前需進(jìn)行校準(zhǔn)。

（2）pH值（pH）：采用電極法進(jìn)行測定，測定前使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液校正儀器。

（3）：采用比重計進(jìn)行測定。

（4）：采用黏度計進(jìn)行測定，將1號轉(zhuǎn)子完全浸入到待測液中，在60 r/min轉(zhuǎn)速下，待黏度示數(shù)穩(wěn)定后讀數(shù)。

（5）：采用電導(dǎo)率儀，對儀器校正后，將電導(dǎo)電極末端浸入待測液體液面以下測定。

（6）：采用表面張力測量儀，對儀器進(jìn)行滿量程校準(zhǔn)，將鉑環(huán)浸入液體中進(jìn)行測試。

（7）：采用折光率儀，測定時用蒸餾水對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，滴2～3滴水煎液于棱鏡上，通過目鏡觀察明暗分界線，使分界線通過十字線焦點(diǎn)，在刻度盤上讀取數(shù)值。

（8）固含量（SC）：采用烘干法進(jìn)行測定。

（9）樣品測定結(jié)果：取15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液，按上述方法對各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行檢測，重復(fù)測定3次，取平均值，結(jié)果見表3。

2.2.2 物理參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換 由于各物理參數(shù)之間存在數(shù)值和量綱的差異，直接分析會影響評價結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)文獻(xiàn)報道[11-12]的物理性質(zhì)指標(biāo)數(shù)值范圍及檢測結(jié)果，對物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化至同一尺度，將轉(zhuǎn)換后的數(shù)值控制在0～10，各物理參數(shù)數(shù)值范圍及轉(zhuǎn)換公式見表4，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理參數(shù)轉(zhuǎn)換后的結(jié)果見表5。

2.2.3 構(gòu)建物理指紋圖譜 采用Origin 2019將轉(zhuǎn)換后的15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)連接起來，構(gòu)成不規(guī)則的八邊形，即升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理指紋圖譜，結(jié)果見圖1。以轉(zhuǎn)換后的15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)的平均值所構(gòu)成的不規(guī)則八邊形為對照物理指紋圖譜，結(jié)果見圖2。構(gòu)建的物理指紋圖譜可直接表現(xiàn)升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液各物理參數(shù)之間差異。

表3 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)檢測結(jié)果

表4 物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換方法

表5 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值

圖1 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液疊加物理指紋圖譜

圖2 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液對照物理指紋圖譜

2.2.4 物理指紋圖譜的應(yīng)用評價 物理指紋圖譜作為中藥水煎液質(zhì)量評價方法，不僅能綜合表征其物理屬性，還能直觀展示出不同批次間物理參數(shù)的相似或差異程度。主要評價方法包括直觀評價法和相似度評價法[13]。直觀評價法即觀察15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的疊加物理指紋圖譜，見圖1，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的pH、、SC、、參數(shù)較為集中，而TDS、、參數(shù)存在差異。

對轉(zhuǎn)換后的15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)進(jìn)行相似度評價，采用SPSS 21軟件計算升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液各批次間Pearson相關(guān)系數(shù)，相似度絕對值越接近1表明標(biāo)準(zhǔn)煎液間物理性質(zhì)越相近。結(jié)果表明，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液相似度均大于0.9，見表6。

表6 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的相似度評價

2.2.5 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)的多變量數(shù)據(jù)分析

（1）層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）：以15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)轉(zhuǎn)化后數(shù)值為變量，使用SPSS 21軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖3，當(dāng)聚類距離＝15時，15批標(biāo)準(zhǔn)煎液聚為2類，A1、A2、A3、A8、A12、A13、A15聚為一類，其余標(biāo)準(zhǔn)煎液聚為一類。

（2）主成分分析（principal component analysis，PCA）：PCA是一種多元統(tǒng)計分析方法，用于對中藥中各種理化指標(biāo)進(jìn)行分析，可簡化復(fù)雜的多指標(biāo)問題[14]。采用SIMCA 14.1進(jìn)行PCA，繪制15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的PCA圖，結(jié)果見圖4。同時應(yīng)用Hotelling’s2和DMod控制圖對15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。PCA提取2個主成分，第1主成分（PC1）、第2主成分（PC2）分別提取74.70%、34.30%的數(shù)據(jù)信息。由PCA圖可知，A1、A2、A3、A8、A12、A13、A15聚分布較為密集，其他樣品分布較為分散，其結(jié)果與HCA結(jié)果一致，說明15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理參數(shù)之間存在波動；由主成分荷載圖（圖5）可知，物理參數(shù)TDS、、pH、、SC、、對主成分1的貢獻(xiàn)較大，主成分2中具有較大載荷，與其關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)。表明TDS、、pH、、SC、、、是升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋圖譜中物理質(zhì)量的差異性指標(biāo)。

圖3 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理指紋圖譜聚類分析圖

圖4 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的PCA圖

圖5 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液載荷圖

建立Hotlling’s2和DMod控制圖對15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，Hotelling’s2和DMod是2個互補(bǔ)的多變量分析手段。Hotelling’s2表示的是每個選定觀察點(diǎn)與模型平面中原點(diǎn)的距離，為模型的內(nèi)部變化度量；DMod表示數(shù)據(jù)在變量空間到主成分模型的距離，為模型的外部變化度量，反映出采樣點(diǎn)偏離模型的程度。通常情況下，在控制線之內(nèi)的樣品為正常樣品，超出控制線的樣品為異常樣品[15]。

15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的Hotelling’s2和DMod控制圖見圖6，圖中的2臨界值（95%）和臨界值（0.05）為控制限，其控制上限分別為8.196 6和1.899，控制圖顯示，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液均在Hotelling’s2和DMod的警戒限內(nèi)。

2.3 6種指標(biāo)成分含量測定

2.3.1 色譜條件

（1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素：色譜柱為Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫：0～25 min，15%～18%乙腈；25～55 min，18%～23%乙腈；55～75 min，23%～27%乙腈；27～90 min，27%～40%乙腈；90～100 min，40%～15%乙腈。

圖6 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的Hotelling’s T2和DMod X的控制圖

（2）芒果苷：色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液（15∶85）；柱溫25 ℃；檢測波長258 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

（3）異阿魏酸：色譜柱為Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（13∶87）；柱溫25 ℃；檢測波長316 nm；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備

（1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素：精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花苷、芒柄花黃素對照品適量，加甲醇制成含毛蕊異黃酮葡萄糖苷98.47 μg/mL、刺芒柄花苷25.15 μg/mL、毛蕊異黃酮98.23 μg/mL、芒柄花黃素49.23 μg/mL的混合對照品溶液。

（2）芒果苷：精密稱定芒果苷對照品適量，加稀乙醇制成含芒果苷497.25 μg/mL的對照品溶液。

（3）異阿魏酸：精密稱定異阿魏酸對照品適量，加甲醇制成含異阿魏酸135.55 μg/mL的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

（1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素：精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液100.00 mL，濃縮至浸膏狀，加5 g硅藻土分散均勻，精密加入甲醇50 mL，超聲（400 W、40 kHz）10 min，濾過，濾液蒸干，用甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

（2）芒果苷：精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液6.50 mL，濃縮至浸膏狀，加2 g硅藻土分散均勻，精密加入稀乙醇25 mL，超聲（400 W、40 kHz）10 min，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

（3）異阿魏酸：精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液110.00 mL，濃縮至浸膏狀，加5 g硅藻土分散均勻，精密加入甲醇25 mL，超聲（400 W、40 kHz）10 min，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4 陰性供試品溶液的制備 按升陷湯處方比例與制備工藝，制備缺黃芪、缺知母、缺升麻的陰性樣品，并按相應(yīng)的供試品溶液制備方法，分別制備缺黃芪、缺知母及缺升麻的陰性供試品溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、黃芪陰性供試品溶液、知母陰性供試品溶液及升麻陰性供試品溶液，分別按“2.3.1（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖7～9。

2.3.6 線性關(guān)系考察 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為49.24、24.62、9.85、4.92、3.28 μg/mL的對照品溶液；取刺芒柄花苷對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為25.15、12.56、5.03、2.52、1.26 μg/mL的對照品溶液；取毛蕊異黃酮對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為24.56、12.28、6.55、4.91、2.46 μg/mL的對照品溶液；取芒柄花黃素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為12.31、6.15、3.28、2.46、1.23 μg/mL的對照品溶液；按“2.3.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷＝24.26＋212.38，＝0.999 5，線性范圍3.28～49.24 μg/mL；刺芒柄花苷＝36.35＋9.52，＝1.000 0，線性范圍1.26～25.15 μg/mL；毛蕊異黃酮＝24.44＋165.39，＝0.999 5，線性范圍2.46～24.56 μg/mL；芒柄花黃素＝37.13＋9.52，＝1.000 0，線性范圍1.23～12.33 μg/mL。

取芒果苷對照品適量，加稀乙醇溶液制成質(zhì)量濃度分別為497.25、248.63、124.31、99.45、49.73 μg/mL的對照品溶液，按“2.3.1（2）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為芒果苷＝3.627 8－0.968，＝0.999 8，線性范圍49.73～497.25 μg/mL。

1-毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2-刺芒柄花苷 3-毛蕊異黃酮 4-芒柄花黃素

圖8 芒果苷對照品溶液(A)、升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液(B)和缺知母陰性供試品溶液(C)的HPLC圖

圖9 異阿魏酸對照品溶液(A)、升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液供試品溶液(B)和缺升麻陰性供試品溶液(C)的HPLC圖

取異阿魏酸對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為21.77、10.89、5.44、4.35、2.72 μg/mL的對照品溶液，按“2.3.1（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為異阿魏酸＝50.245－7.597 2，＝0.999 7，線性范圍2.72～21.77 μg/mL。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1），按“2.3.3（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計算各指標(biāo)成分峰面積的RSD分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.25%、刺芒柄花苷1.06%、毛蕊異黃酮1.18%、芒柄花黃素1.11%、芒果苷1.76%、異阿魏酸1.29%。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1），按“2.3.3（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下方法分別平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算各成分質(zhì)量濃度的RSD分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.73%、刺芒柄花苷0.65%、毛蕊異黃酮0.82%、芒柄花黃素0.78%、芒果苷0.84%、異阿魏酸0.79%。

2.3.9 穩(wěn)定性考察 精密量取升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1），按“2.3.3（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后1、3、6、9、12、18、24 h，按“2.3.1（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算各成分色譜峰峰面積的RSD分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.06%、刺芒柄花苷1.08%、毛蕊異黃酮1.10%、芒柄花黃素1.02%、芒果苷1.25%、異阿魏酸1.12%。

2.3.10 加樣回收率考察 精密量取已測定指標(biāo)成分含量的6份升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1）各50.00 mL，分別精密加入等量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素對照品，按“2.3.3（1）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算各成分加樣回收率和RSD，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素的平均加樣回收率分別為99.86%、98.47%、100.25%、99.52%，RSD分別為1.84%、1.69%、2.01%、1.92%。

精密量取已知含量的6份升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1）3.30 mL，精密加入等量的芒果苷對照品，按“2.3.3（2）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1（2）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算得芒果苷的平均加樣回收率和RSD分別為98.72%和1.16%。

精密量取已知含量的6份升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液（A1）55.00 mL，精密加入等量的異阿魏酸對照品，按“2.3.3（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算得異阿魏酸的平均加樣回收率和RSD分別為98.99%和1.08%。

2.3.11 樣品測定 取15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液，分別按“2.3.3（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1（1）、（2）、（3）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰，計算15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、芒果苷、異阿魏酸含量，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地藥材會造成指標(biāo)成分含量差異，在經(jīng)典名方研發(fā)過程中，盡可能選擇道地藥材進(jìn)行投料。以15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液指標(biāo)成分含量為變量，采用SPSS 21軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖10，當(dāng)平均歐式距離為15時，15批樣品聚為2類，A1、A2、A3、A8、A12、A13、A15聚為一類，其余樣品聚為另一類[16]，其結(jié)果與物理指紋圖譜HCA結(jié)果一致。

表7 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液中6種指標(biāo)成分含量測定結(jié)果

圖10 15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液指標(biāo)成分含量HCA圖

3 討論

中藥水煎液是中藥制劑研發(fā)的基礎(chǔ)。中藥在煎煮過程中其物理化學(xué)參數(shù)與中藥的成分、藥效之間存在著必然聯(lián)系，本研究選擇8個物理參數(shù)構(gòu)建水煎液的物理指紋圖譜，更全面地對中藥水煎液進(jìn)行評價。中藥在煎煮過程中，水煎液中脂肪酸類、酚酸類及黃酮類等電離出的氫離子量會影響其pH值，進(jìn)而反映其質(zhì)量。在提取過程中細(xì)胞中生物堿和無機(jī)鹽等成分透過細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)向水中擴(kuò)散，并以鹽的形式分散在水中，使得水煎液顯示電信號，導(dǎo)致溶液的值呈范圍性波動，水煎液的大小可反映細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)擴(kuò)散到水中的多少，進(jìn)而反應(yīng)化學(xué)成分的擴(kuò)散和提取規(guī)律[17-18]。水煎液中皂苷類及黃酮類等成分與水作用，使其具有一定的表面活性可反映水煎液的物理化學(xué)性質(zhì)及組成。有研究表明，當(dāng)溫度一定時，與溶液中分子結(jié)構(gòu)、分子間作用力有密切關(guān)系[19]，可作為水煎液質(zhì)量評價的一項(xiàng)重要指標(biāo)。TDS及固含量能反應(yīng)出水煎液中可溶物和不溶物的提取總量，在一定程度上表征著水煎液的質(zhì)量。因此，選擇TDS、、、pH、、、、SC構(gòu)建升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液物理指紋圖譜。

對15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的物理指紋圖譜進(jìn)行疊加，結(jié)果表明，物理參數(shù)pH、、SC、、指標(biāo)較為集中，而TDS、、指標(biāo)之間存在差異。15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的值均大于純水值且有一定差異，其原因可能是標(biāo)準(zhǔn)煎液中的黃芪甲苷、知母皂苷、桔梗皂苷等多種皂苷類成分中的苷元具有不同程度的親脂性，糖鏈具有較強(qiáng)的親水性，近而影響值[20]。由于與中藥水煎液中淀粉、果膠等高分子物質(zhì)的含量密切相關(guān)[21]，因此，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液的存在差異的主要原因可能是煎煮過程中高分子物質(zhì)溶出差異造成的。TDS與水煎液內(nèi)的化學(xué)成分溶出密切相關(guān)，15批升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液化學(xué)成分溶出不同，從而對物理參數(shù)TDS有影響。

選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花黃素、芒果苷、異阿魏酸6種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，并對質(zhì)量濃度進(jìn)行聚類分析，分類結(jié)果與物理指紋圖譜的分類結(jié)果相一致，說明物理指紋圖譜可以表征煎液體系的內(nèi)在質(zhì)量變化，可用于標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量控制及其一致性評價。該方法操作簡單，所需時間短，成本低，可動態(tài)監(jiān)控中藥煎煮的全過程，為中藥水煎液質(zhì)量研究提供科學(xué)依據(jù)。本課題組將繼續(xù)深入研究指標(biāo)成分與物理化學(xué)參數(shù)的傳變規(guī)律，以構(gòu)建更全面、系統(tǒng)的中藥水煎液質(zhì)量評價體系。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 杜克群, 成顏芬, 李敏敏, 等. 基于特征圖譜與5種成分含量的經(jīng)典名方桃紅四物湯量值傳遞分析 [J]. 中草藥, 2022, 53(22): 7058-7069.

[2] 陳秋薇, 章津銘, 季寧平,等. 附子-甘草藥對配伍前后湯液相態(tài)對比 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(2): 92-95.

[3] 文謹(jǐn), 劉起華, 柯李晶, 等. 表征中藥煮散的粉體特征參數(shù)及水煎液中的分散溶出行為研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(23): 3489-3494.

[4] Nofrerias I, Nardi A, Su?é-Pou M,. Comparison between microcrystalline celluloses of different grades made by four manufacturers using the SeDeM diagram expert system as a pharmaceutical characterization tool [J]., 2018, 342: 780-788.

[5] 梁悅, 劉濤, 蔣天宇, 等. 生脈注射液物理指紋圖譜的建立及其質(zhì)量評價 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2571- 2576.

[6] 常麗靜, 李明月,韋花花, 等. 升陷湯標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC- ELSD特征指紋圖譜建立及3種成分測定 [J]. 中成藥, 2021, 43(8): 2010-2016.

[7] 馬家驊, 李霞, 譚承佳, 等. 基于藥效理化表征的當(dāng)歸補(bǔ)血湯質(zhì)量控制模式初探 [J]. 中草藥, 2012, 43(5): 901-905.

[8] 唐玉, 張愛軍, 李帥, 等. 基于QbD理念的七味蟾參顆粒制備工藝及物理指紋圖譜研究 [J]. 中藥材, 2021, 44(1): 146-152.

[9] 周蔚昕, 劉濤, 劉錢, 等. 川芎飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC及物理指紋圖譜研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(21): 5107-5115.

[10] 伍蕊嗣, 劉濤, 覃盼盼, 等. 熱毒寧注射液物理指紋譜研究及應(yīng)用 [J]. 中國中藥雜志, 2017, 42(3): 505-509.

[11] 馬家驊, 譚承佳, 李霞, 等. 基于有效組分檢測與理化表征相結(jié)合的當(dāng)歸補(bǔ)血湯制備工藝與質(zhì)量控制研究[J]. 中草藥, 2012, 43(3): 482-486.

[12] 梁悅, 劉濤, 蔣天宇,等. 生脈注射液物理指紋圖譜的建立及其質(zhì)量評價 [J]. 中草藥, 2018, 49(11): 2571-2576.

[13] 劉濤, 付春梅, 唐玉, 等. 不同干燥方式對桑枝提取物物理指紋圖譜及其總黃酮含量的影響 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2019, 25(3): 34-38.

[14] 滕凱旋, 傅豪, 王中昌, 等. 基于物理指紋圖譜的養(yǎng)胃顆粒浸膏質(zhì)量一致性評價方法 [J]. 中草藥, 2022, 53(3): 712-719.

[15] 侯一哲, 黎翩, 肖紅敏, 等. 血塞通滴丸皂苷類成分含量測定及批次一致性評價研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(11): 2552-2559.

[16] 李明月, 常麗靜, 韋花花,等. 不同干燥方式黃芪提取物理化性質(zhì)及HPLC-ELSD指紋圖譜的比較 [J]. 中成藥, 2022, 44(9): 3068-3075.

[17] 莫平莉, 王洛臨, 盧泳, 等. 黃芪配方顆粒提取過程中3種指標(biāo)成分的傳質(zhì)規(guī)律 [J]. 中成藥, 2019, 41(5): 979-982.

[18] 孫冬梅, 陳卉, 王洛臨, 等. 電導(dǎo)率測定法在中藥有效成分提取過程中的應(yīng)用研究 [J]. 中成藥, 2015, 37(12): 2686-2690.

[19] 范加金, 張曉杰, 王立增,等. 折射儀法測定氯化鈣注射液含量 [J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn), 2022, 23(3): 326-329.

[20] 羅石任, 鄭旭霞, 殷娜, 等. 平樂正骨活血靈湯的制備工藝優(yōu)化及電導(dǎo)率用于湯劑的質(zhì)量控制研究 [J]. 中國處方藥, 2022, 20(5): 15-18.

[21] 單東杰, 羅秀明, 常艷麗, 等. 基于化學(xué)計量學(xué)研究莪術(shù)-三棱藥對水煎液物理參數(shù)與化學(xué)成分的相關(guān)性 [J]. 中草藥, 2022, 53(17): 5363-5378.

Construction of quality evaluation method for standard decoction of Shengxian Decoction based on physical fingerprint and multi index component content determination

YANG Wan, ZOU Hai-ying, QIU Zhi-dong, YANG Jing, CHEN Xin

Key Laboratory for Effective Substances of Genuine Medicinal Material in Changbai Mountain, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China

To establish the physical fingerprint of the standard decoction of Shengxian Decoction (升陷湯), and to determine the contents of six index components (calycosin-7--β--glucoside, ononin, calycosin, formononetin, mangiferin and isoferulic acid), lay a foundation for its quality evaluation.Fifteen batches of standard decoction of Shengxian Decoction were porepared based on the concept of abiding by the ancient times. The physical fingerprint of the standard decoction of Shengxian Decoction was constructed from eight physical parameters: Total dissolved solids (TDS), hydrogen ion concentration (pH), density (), dynamic viscosity (), conductivity (), surface tension (), refractive index (), and solid content (SC). The similarity evaluation, principal component analysis (PCA) and hierarchical cluster analysis (HCA) were used to evaluate the physical fingerprint and judge the abnormal samples. The content of six index components of calycosin-7--β--glucoside, ononin, calycosin, formononetin, mangiferin and isoferulic acid were determined by HPLC. Combined with multivariate statistical analysis method.The physical fingerprints of 15 batches of standard decoction of Shengxian Decoction were different, mainly reflected in three indicators: TDS,and. The results of similarity analysis and PCA showed that the similarity of 15 batches of standard decoction was greater than 0.9, they were grouped into two categories, A1, A2, A3, A8, A12, A13 and A15 into one category, and the rest of the standard decoctions were grouped into one category. The monitoring of DModcontrol chart showed that 15 batches of standard decoctions are all normal samples. The mass concentrations of six index components in 15 batches of standard decoctions were respectively 4.81—6.30 μg/mL of calycosin-7--β--glucoside, 1.50—1.78 μg/mL of ononin, 3.50—4.65 μg/mL of calycosin, 1.33—1.63 μg/mL of formononetin, 68.33—75.23 μg/mL of mangiferin, 3.50—5.65 μg/mL of isoferulic acid. The HCA results of 15 batches of standard decoctions were consistent with those of physical fingerprint.The physical fingerprint and index component content determination method of Shengxian Decoction can be used for consistency evaluation, quality control and dynamic monitoring of the whole decoction process.

Shengxian Decoction; standard decoction; physical fingerprint; quality evaluation; calycosin-7--β--glucoside; ononin; calycosin; formononetin; mangiferin; isoferulic acid;principal component analysis

R283.6

A

0253 - 2670(2023)06 - 1804 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.012

2022-11-06

吉林省科技發(fā)展計劃項(xiàng)目（20180201089YY）；重大疫情防治中藥方劑儲備庫建設(shè)項(xiàng)目（吉中醫(yī)藥發(fā)［2021］11號）；校企合作項(xiàng)目（2018-2200-02-000490）

楊 婉（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖皬?fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。Tel: 13944496637 E-mail: 3391589859@qq.com

陳 新（1965—），女，碩士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Tel: 13596000134 E-mail: 1253068357@qq.com

楊 晶（1979—），女，碩士生導(dǎo)師，副教授，從事中藥制劑研究。Tel: 13500813952 E-mail: 764130589@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]