電刺激干預(yù)骨代謝相關(guān)信號(hào)通路研究進(jìn)展

黃委委 李鼎鵬 李寧 韓憲富 林德民 李建國(guó) 丁聚賢 謝興文

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000 3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)作為一類臨床常見的代謝性骨病，主要依賴于成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)及破骨細(xì)胞(osteoclasts，OC)維持骨穩(wěn)態(tài)，骨穩(wěn)態(tài)一旦失衡，就會(huì)導(dǎo)致骨量流失和骨密度下降，嚴(yán)重時(shí)可引起脆性骨折等問題[1]。近年來，隨著人口老齡化程度的不斷加劇，患者的正常生活也因OP并發(fā)癥而受到了非常嚴(yán)重的影響，因此高效而便捷的治療手段更顯得尤為重要[2-3]。大量研究證實(shí)[4-7]，正常機(jī)體骨骼微環(huán)境中的骨膜、骨組織中存在著生理電位，骨細(xì)胞可能通過電信號(hào)來感知細(xì)胞外網(wǎng)絡(luò)中的機(jī)械力，當(dāng)受到內(nèi)部或外部電刺激時(shí)，骨骼微環(huán)境中的相關(guān)信號(hào)通路、因子分泌可被介導(dǎo)而直接或間接影響OB及OC維持的骨穩(wěn)態(tài)[8-10]。但由于OP發(fā)病機(jī)制的相關(guān)假說較多，電刺激干預(yù)OP的相關(guān)機(jī)制尚未明確，本文從OP相關(guān)信號(hào)通路及細(xì)胞因子角度出發(fā)，以闡釋電刺激干預(yù)OP的潛在機(jī)制，從而為OP治療方案提供一些思路和理論支撐。

1 電刺激

1.1 骨壓電效應(yīng)

應(yīng)力作用引起骨內(nèi)電位促進(jìn)骨重建最早由Bassett等發(fā)現(xiàn)，并提出相關(guān)猜想。Yasuda和Fukada的相關(guān)報(bào)道也再次證明了壓電效應(yīng)在骨組織中的存在[11]。Gittens等[12]的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，骨的動(dòng)態(tài)平衡與骨受力引起的力電相關(guān)。其他學(xué)者[13]在研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，骨組織受力變形引起內(nèi)部液體流動(dòng), 載荷信號(hào)傳遞到骨單元,進(jìn)而產(chǎn)生一系列相關(guān)物理效應(yīng)并被細(xì)胞感知而做出相應(yīng)反應(yīng)，這些反應(yīng)就是誘導(dǎo)骨重建的基本機(jī)制。也有學(xué)者[14]提出，骨壓電與膠原及骨組織中的膠原蛋白分子受力后產(chǎn)生的變化有關(guān)。

1.2 電刺激概述

電刺激是指采用電流對(duì)機(jī)體進(jìn)行干預(yù)，并觀察其行為效應(yīng)。常見的電刺激形式有恒定直流電、脈沖直流電和脈沖電磁場(chǎng)3種；常見刺激方法亦有3種：完全埋入法、半埋入法以及非埋入法[15]。目前，主要應(yīng)用于心理學(xué)研究以及臨床疾病的治療等方面。電刺激作為骨科疾病一種有效治療手段，在骨折、骨缺損以及軟組織損傷等方面優(yōu)勢(shì)突出，可促進(jìn)骨的的修復(fù)與再生，其效果受刺激持續(xù)時(shí)間、頻率、波形等條件所限制[16]。研究指出，電刺激可通過改變細(xì)胞液氧張力及pH值，產(chǎn)生多種“感應(yīng)電產(chǎn)物”(如過氧化氫等)促進(jìn)骨形成。而電刺激引起的電流變化也能激活OC、OB，促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)，從而對(duì)機(jī)體骨的代謝起著重要作用，這主要體現(xiàn)在促進(jìn)OC生長(zhǎng)和抑制OB生長(zhǎng)兩個(gè)方面。OC在電刺激的作用下，能夠激發(fā)脫氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid，DNA) 的合成，有效促進(jìn)OC增殖[15]。脈沖電磁場(chǎng)刺激OB也會(huì)顯著增加其脫氧核糖核酸 DNA合成, 加速分裂, 最終顯示出快速增殖的細(xì)胞群體[17]。相關(guān)研究[15]發(fā)現(xiàn)，磁場(chǎng)恒定強(qiáng)度下可使OB脫壁或胞質(zhì)空泡化，進(jìn)而使其不能形成皺褶膜，最終降低其骨吸收能力。同時(shí)，電磁場(chǎng)也會(huì)引起環(huán)磷酸腺苷(c AMP)水平升高，繼而刺激細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)及蛋白激酶A(PKA)激活[18]。由此可知，電刺激對(duì)于OP的防治機(jī)制是可循的。

2 相關(guān)信號(hào)通路途徑

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt/β-catenin作為一個(gè)哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育關(guān)鍵通路，在細(xì)胞增殖、損傷修復(fù)調(diào)控和OP發(fā)病過程中扮演著重要角色[19-20]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin通路活化可被外源電刺激強(qiáng)化。在相關(guān)動(dòng)物研究[21]中證實(shí)，外源電刺激可明顯提高大鼠脊髓組織中Wnt-1和β-catenin mRNA表達(dá)水平。低電壓(3.5 V)和低頻率(1 MHz或2 MHz)交流條件誘導(dǎo)人毛乳頭細(xì)胞(human dermal papilla cells，hDPC)體外增殖的實(shí)驗(yàn)中，也觀察到Wnt/β-catenin、Ki67、p-ERK和p-AKT表達(dá)顯著增加[22]。分析其作用機(jī)制可能與Wnt-1和β-catenin蛋白在交感運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)、交感神經(jīng)的興奮增加相關(guān)[23]。Wnt通路調(diào)控中具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子7(TCF7)在電休克療法(electroconvulsive therapy，ECT)中也明顯提高[24]，這也證實(shí)了電刺激與Wnt/β-catenin通路的相關(guān)性。

2.2 BMP/Smads信號(hào)通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)家族，在功能上具有誘導(dǎo)新骨形成的能力[25]。

研究[26]發(fā)現(xiàn)，將OB培養(yǎng)在電活性苯胺五聚體(AP)聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)復(fù)合材料上并施加電脈沖，聚合物和電脈沖的結(jié)合可增強(qiáng)OB成骨分化，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、I型膠原和骨連接素的上調(diào)表達(dá)以及Samd4的磷酸化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[27]中也證實(shí)了直流電刺激(direct current electric stimulation, DCES)能夠上調(diào)骨誘導(dǎo)因子的表達(dá)，調(diào)控新骨的形成和融合，增強(qiáng)OB中BMP-2、BMP-6和BMP-7的正常生理表達(dá)。該研究還指出，成骨脊柱器械在融合部位提供集中的DCES，促進(jìn)了脊柱的機(jī)械穩(wěn)定和新骨形成和骨融合的成骨刺激。此外，DCES也能刺激巨噬細(xì)胞釋放血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，間接在骨發(fā)育與重塑中發(fā)揮作用。

2.3 MAPK信號(hào)通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路作為OB分化和骨形成的正調(diào)節(jié)因子，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，分為p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)通路[28]。

2.3.1p38信號(hào)通路：作為p38 MAPK通路關(guān)鍵蛋白，p38可介導(dǎo)前凋亡信號(hào)、生長(zhǎng)抑制信號(hào)和炎性反應(yīng)[29]。過度磷酸化的p38 MAPK可導(dǎo)致OB凋亡[30]。p38 MAPK活化被抑制時(shí)，p38 MAPK調(diào)控細(xì)胞凋亡途徑之一的p53磷酸化過程將會(huì)受到抑制，細(xì)胞凋亡作用也會(huì)減弱[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，電刺激坐骨神經(jīng)損傷大鼠“環(huán)跳”穴可抑制p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，從而使坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡受到抑制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[33]中也發(fā)現(xiàn)，急性電刺激可通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)或p38信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α(PGC-1α)轉(zhuǎn)錄水平以及翻譯后蛋白水平活性上調(diào)。

2.3.2JNK信號(hào)通路：主要位于細(xì)胞質(zhì)的JNK受到上游信號(hào)刺激激活后，移位至細(xì)胞核的JNK完全活化并具有酶催化活性，參與細(xì)胞調(diào)控[34]。部分研究[35]也指出，細(xì)胞損傷、凋亡可因JNK被抑制而同樣受到抑制。相關(guān)動(dòng)物研究[36]發(fā)現(xiàn)，廢用性肌萎縮的肌纖維細(xì)胞中明顯降低磷酸化JNK、ERK1/2、p38 蛋白表達(dá)在受到電刺激后明顯上調(diào)。

2.3.3ERK1/2及ERK5信號(hào)通路：ERK1/2屬于骨與骨髓中最豐富的p38成員，可被多種來源刺激所激活，促進(jìn)OB增殖[28,37]。實(shí)驗(yàn)研究[38-39]發(fā)現(xiàn)，電刺激能夠抑制ERK1/2通路活化及抑制損傷脊髓ERK表達(dá)。其他研究還提出，直流電場(chǎng)(direct current electric fields ,DCEFs)通過激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞定向遷移。超氧物可能通過調(diào)節(jié)Akt及Erk1/2活化，影響在DCEF誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞定向遷移[40]。這也證明超氧物在DCEF介導(dǎo)的細(xì)胞定向遷移過程中可能作為連接細(xì)胞外電刺激與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)之間的橋梁之一。

2.4 Notch信號(hào)通路

Notch通路主要由Notch受體、Jagged配體以及下游Hes因子組成[41]。大量實(shí)驗(yàn)研究[42-43]證實(shí)，Notch通路在血管新生、OB分化及骨穩(wěn)態(tài)維持中也發(fā)揮著極為關(guān)鍵的作用。研究[44]發(fā)現(xiàn)，電信號(hào)可刺激上調(diào)下L929細(xì)胞的增殖相關(guān)基因-增殖細(xì)胞核抗原(Pcna)、兩個(gè)遷移相關(guān)基因-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(Fgf2)和δ樣非規(guī)范Notch配體1(Dlk1)。實(shí)驗(yàn)研究[45]證實(shí)，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能夠通過電刺激抑制Notch通路而達(dá)到。分析其機(jī)制可能與電刺激通過調(diào)控Notch1和mash1的表達(dá)抑制了Notch通路有關(guān)。

2.5 NF-κB信號(hào)通路

核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)作為OP治療的經(jīng)典通路，在細(xì)胞增殖、分化及機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等多種應(yīng)激反應(yīng)中也具有重要作用。研究[46-47]指出，電刺激可降低急性心肌缺血(acute myocardial ischemia,AMI)小鼠心肌組織NF-κB p65等相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平及NF-κB p65表達(dá)。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)[48]中還證實(shí)，電刺激還可通過激活NF-κB信號(hào)調(diào)控Bcl-2增強(qiáng)抗凋亡作用，減輕肌細(xì)胞凋亡。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[49]也發(fā)現(xiàn)，迷走神經(jīng)電刺激(vagus nerve stimulation,VNS)能夠抑制NF-κB p65和p-IκBα的蛋白表達(dá)升高。

2.6 PI3K/Akt信號(hào)通路

PI3k/Akt通路作為細(xì)胞增殖、凋亡及自噬行為的重要生存通路，在控制骨密度平衡中也具有重要作用[50-51]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[52]指出，電刺激能激活NRG-1/ErbB-PI3K/Akt通路，促進(jìn)NRG1、ErbB、PI3K、Akt mRNA及蛋白的表達(dá)。其他研究[53]也發(fā)現(xiàn)，電針可激活PI3K/Akt通路改善肌衛(wèi)星細(xì)胞過度自噬，保護(hù)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。

3 骨形成相關(guān)因子

3.1 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種重要細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)血管生成及骨發(fā)育、生長(zhǎng)和修復(fù)的過程中均有重要作用。部分學(xué)者[54]研究發(fā)現(xiàn)，電刺激能明顯升高VEGF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和血管生成素1水平，并上調(diào)血管生成素受體2和VEGF受體2水平，在糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合及新血管生成過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。其他臨床研究也發(fā)現(xiàn)，不同類型電刺激配合藥物治療中，VEGF水平均有明顯升高，但其具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探究。

3.2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子

研究證實(shí)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor, FGF)能夠促進(jìn)OB增殖和分化[55]。動(dòng)物研究[56]發(fā)現(xiàn)，電刺激可明顯上調(diào)缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織細(xì)胞生長(zhǎng)因子b FGF。但實(shí)驗(yàn)[57]指出，治療效果受到治療介入時(shí)機(jī)及持續(xù)時(shí)間影響。同時(shí)，F(xiàn)GF-2 mRNA合成在電刺激后也會(huì)有明顯增加。這表明電刺激對(duì)FGF分泌具有正向作用，在OP治療中也存在可行性。

3.3 血小板生長(zhǎng)因子

血小板生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)增殖、成骨分化過程及新生血管維持中都有著重要作用。研究[58]發(fā)現(xiàn)，電刺激足三里、三陰交、梁門穴可提高PDGF含量和改善線粒體超微結(jié)構(gòu)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，斑塊內(nèi)PDGF-BB、PDGFR-AB表達(dá)可在受到電刺激后上調(diào)。

4 電刺激治療OP的相關(guān)臨床研究

電刺激在臨床中的應(yīng)用范圍較為廣泛。目前，在治療骨科疾病(如骨折、骨缺損、OP等)方面受到的關(guān)注也越來越多，臨床也隨之開展了一系列研究。相對(duì)而言，現(xiàn)有OP方面的臨床研究相對(duì)薄弱，且主要以改善患者疼痛等癥狀為主，缺乏較深層次的臨床方面的機(jī)制研究。姚娜等[59]對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了分析、梳理，并探討了經(jīng)皮穴位電刺激緩解OP引起的疼痛的機(jī)理，認(rèn)為電刺激可通過調(diào)節(jié)激素、細(xì)胞因子水平、改善血流動(dòng)力學(xué)以及抑制痛覺等，從而起到作用。李桂錦等[60]和時(shí)克昌等[61]運(yùn)用了同樣的方法進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，即選用益骨湯和經(jīng)皮穴位電刺激治療老年性O(shè)P疼痛，結(jié)果雖然證實(shí)了電刺激可改善患者疼痛，但作用機(jī)制未予闡明。

5 小結(jié)與展望

綜上可知，電刺激作為一種有效的治療手段，其效果也被大量實(shí)驗(yàn)研究予以證實(shí)。通過上述對(duì)電刺激干預(yù)骨形成相關(guān)通路及因子的總結(jié)可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)相關(guān)的重要通路或因子予以電刺激來治療OP是具有可行性的。因?yàn)殡姶碳た梢哉{(diào)控這些關(guān)鍵信號(hào)通路和因子，但是部分通路尚缺乏研究驗(yàn)證，且從臨床角度而言，電刺激改變生理電位來治療OP仍存在較多需要解決的問題。首先，如何快速給不同患者制定有效的個(gè)體化治療方案便給電刺激干預(yù)帶來不小的挑戰(zhàn)；其次，不同種類電刺激的效果差異及電刺激治療中治療時(shí)機(jī)和治療期間其他組織不良反應(yīng)等多重因素的影響也是臨床治療中不可忽略的問題。同時(shí)，就目前研究而言，大量試驗(yàn)研究尚不能證明電刺激干預(yù)OP相關(guān)通路及因子對(duì)其他相關(guān)因子及通路不存在抑制作用，而從治療的方向而言，以單個(gè)信號(hào)通路或骨形成相關(guān)因子作為治療的靶點(diǎn)也是明顯存在較大限制的。因此，只有把更加深入地探索與臨床治療有機(jī)地結(jié)合起來，才能在OP治療和發(fā)病機(jī)制的研究中取得更大的突破。