接觸腦脊液神經(jīng)元及其神經(jīng)干細胞特性相關(guān)研究進展

嚴(yán)偉紅，楊磊落，曹 亮，張 毅，皮文俊

接觸腦脊液神經(jīng)元(CSF-cNs)是中間神經(jīng)元的一個亞群，在中央管內(nèi)表現(xiàn)為頂端球狀延伸，并將基底軸突投射發(fā)送到其他細胞。雖然CSF-cNs早在近一個多世紀(jì)前就被發(fā)現(xiàn)了，但其具體特征和功能才剛剛開始被揭示。最近大量研究詳細闡述了CSF-cNs的特征，包括形態(tài)、分類、空間分布及特異性標(biāo)志物等。隨著對CSF-cNs的深入探索，現(xiàn)有部分研究者發(fā)現(xiàn)其可能是位于脊髓中央管及其周圍的神經(jīng)干細胞，在脊髓損傷后可能發(fā)揮很重要的作用。因此，本文對國內(nèi)外關(guān)于CSF-cNs及其神經(jīng)干細胞特性的相關(guān)研究進展進行綜述如下。

1 CSF-cNs的鑒定

CSF-cNs是位于脊髓中央管周圍的一類獨特的神經(jīng)元，與腦脊液保持接觸[1]。其一部分位于脊髓中央管的室管膜層及其周圍脊髓實質(zhì)內(nèi)[2]，另一部分相對集中分布于中腦與腦橋交界處導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)中[3]。在哺乳動物的延髓和脊髓中，CSF-cNs是雙極細胞，具有單一的類球狀樹突突出至中央管與腦脊液接觸，并有一個細薄的無髓軸突終止于前正中裂的軟膜面[1]。KOLMER[4-6]和AGDUHR[7]觀察并描述了大多數(shù)脊椎動物脊髓中CSF-cNs形態(tài)，而DALE等[8]將其命名為KA細胞。隨后，VIGN和VIGH-TEICHMANN[9]用電子顯微鏡研究了CSF-cNs的特殊形態(tài)，發(fā)現(xiàn)CSF-cNs具有伸入中央管的樹突狀末端。

PARK等[10]根據(jù)CSF-cNs在斑馬魚中的位置及起源，將KA細胞分為KA '(背側(cè))和KA''(腹側(cè))2種細胞亞群。相對KA '細胞位于運動神經(jīng)元前體(PMN)區(qū)域，KA''細胞主要分布于側(cè)底板(LFP)區(qū)域[10-12]，且細胞命運圖顯示，所有KA '細胞均來源于PMN區(qū)域Oleg2+祖細胞，而KA''細胞來源于LFP區(qū)域Nkx2.2a+/Nkx2.2b+/Nkx2. 9+祖細胞[10]。大多數(shù)CSF-cNs在斑馬魚受精后16.5 h左右產(chǎn)生[13-15]。同樣的，在小鼠脊髓中CSF-cNs也由2個不同的背腹區(qū)域組成[16]，其中大多數(shù)CSF-cNs來源于Nkx6+/Pax6+祖細胞，主要位于p2神經(jīng)祖細胞結(jié)構(gòu)域和少突膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)域的背側(cè)部分，而少部分CSF-cNs亞群起源于p3神經(jīng)祖細胞結(jié)構(gòu)域和底板之間邊界的Nkx2.2+/Foxa2+前體細胞[17]。這2個CSF-cNs亞群的發(fā)育受到Pax6精確調(diào)控，且出生后因在中央管周圍的位置不同，從而表現(xiàn)出電生理差異[11,18-19]。

2 CSF-cNs的生物標(biāo)志

盡管CSF-cNs已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了一個多世紀(jì)，但因其缺乏特異性標(biāo)志物，人們對它的功能了解依然十分模糊。直到2006年，HUANG等[20]首次通過實驗研究確定了多囊腎病2樣1通道蛋白(PKD2L1)可作為CSF-cNs的特異性標(biāo)志物，PKD2L1的發(fā)現(xiàn)為研究CSF-cNs的細胞特性提供了基礎(chǔ)。隨后，有研究者稱可以借助GATA結(jié)合蛋白2(GATA2)和GATA結(jié)合蛋白3(GATA3)等轉(zhuǎn)錄因子來輔助CSF-cNs的鑒定[18-21]。此外，有學(xué)者在CSF-cNs中也發(fā)現(xiàn)了γ-氨基丁酸(GABA)和酸敏感離子通道(ASICs)[22]。這些發(fā)現(xiàn)無疑對CSF-cNs的進一步研究具有重要意義。

2.1CSF-cNs和PKD2L1 PKD2L1屬于瞬時電位受體家族[23-24]。PKD2L1最初被鑒定為味蕾中的酸味受體，在小鼠、斑馬魚和獼猴的脊髓腦脊液、中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)[18]。PKD2L1是一種對細胞外pH值和滲透壓變化敏感的感覺傳導(dǎo)蛋白，可感知腦脊液流量和脊髓扭轉(zhuǎn)[19-20]。盡管那時腦脊液pH和滲透壓的生理變化尚不清楚，但這些觀察結(jié)果表明CSF-cNs可能是受腦脊液的化學(xué)和(或)機械信號調(diào)節(jié)的相互感受器。值得注意的是，PKD2L1通道在小鼠、獼猴和斑馬魚的脊髓CSF-cNs中是保守的，這些物種的脊髓CSF-cNs選擇性地表達PKD2L1。目前，PKD2L1被廣泛認(rèn)為是CSF-cNs的一個特異性標(biāo)志物，當(dāng)細胞外或細胞內(nèi)鈣離子升高或處于低滲狀態(tài)時，該通道承擔(dān)了CSF-cNs中大電流的功能。PKD2L1能夠產(chǎn)生足夠的去極化以觸發(fā)動作電位，從而可作為一個尖峰發(fā)生器。另外，有研究發(fā)現(xiàn)多囊腎病1樣2通道蛋白(PKD1L2)和PKD2L1在CSF-cNs中選擇性地共同表達，表明PKD1L2可能調(diào)節(jié)PKD2L1的活性及其在膜上的定位，以避免CSF-cNs的過度興奮[25]?？傊琍KD2L1的發(fā)現(xiàn)為探索CSF-cNs的生理功能提供了一個明確的方向[26]。

2.2CSF-cNs和GABA GABA被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[27]。然而，GABA在發(fā)育早期階段是興奮性的，在神經(jīng)元分化的后期階段逐漸變成抑制性。GABA在CSF-cNs中的表達首先在大鼠中被報道。此后，CSF-cNs的GABA表達在許多物種中被發(fā)現(xiàn)。DALE等[8,22]命名了一類CSF-cNs，它位于青蛙胚胎脊髓的外側(cè)，通過使用抗神經(jīng)遞質(zhì)GABA和谷氨酸脫羧酶他們報道了CSF-cNs解剖學(xué)的更多詳細信息，包括軸突投射模式、發(fā)育過程中外觀，以及在青蛙和斑馬魚中的分布、組織。CSF-cNs的GABA能表型，結(jié)合其在中央管周圍與管腔接觸的位置，成為識別CSF-cNs的主要分子標(biāo)準(zhǔn)[22]。

2.3CSF-cNs和轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子在CSF-cNs的生成和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。ASCL1是基本螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子之王，控制著中央管脊髓中CSF-cNs和上皮細胞的平衡，并在CSF-cNs的前體細胞中高度表達[28]。Nkx6.1也是一個轉(zhuǎn)錄因子，能使運動神經(jīng)元分化，PKD2L1+CSF-cNs表達Nkx6.1[29]。Pax6是包含配對盒的轉(zhuǎn)錄因子成員，在小鼠中Pax6在PKD2L1+CSF-cNs細胞部分背側(cè)亞群中表達，且在CSF-cNs神經(jīng)發(fā)生過程中Pax6的表達顯著下調(diào)[18]。有研究表明可聯(lián)合使用轉(zhuǎn)錄因子Nkx6.1和Pax6作為CSF-cNs的標(biāo)志[18]。此外，Nkx2.2和Foxa2是參與胚胎發(fā)育和分化的轉(zhuǎn)錄因子，可用于識別部分斑馬魚中的CSF-cNs[30]。在以往的研究中，CSF-cNs的鑒定基本依賴于PKD2L1的表達。然而，近期有研究發(fā)現(xiàn)GATA2和GATA3轉(zhuǎn)錄因子在CSF-cNs中有特異性表達，因其有著不同的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，所以可用于鑒別不同亞群的CSF-cNs[21-31]。PETRACCA等[18]建議將PKD2L1與轉(zhuǎn)錄因子GATA2、GATA3聯(lián)合作為CSF-cNs的識別標(biāo)志，且在后來的研究中他們多次使用了這2個轉(zhuǎn)錄因子作為標(biāo)志以識別CSF-cNs。因此，CSF-cNs的雙重標(biāo)志無疑會促進研究者對其未來的生物學(xué)及功能研究。

2.4CSF-cNs和ASICs 體內(nèi)酸堿平衡對生物體的生存至關(guān)重要，ASICs在感知pH變化中發(fā)揮重要作用，是細胞外質(zhì)子門控興奮性陽離子通道，在3種已鑒定的ASICs亞型中，酸敏感離子通道3(ASIC3)廣泛表達于感覺神經(jīng)元和神經(jīng)末梢，在那里機械和傷害性刺激被轉(zhuǎn)化為電信號。ASIC3通道廣泛存在于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，在中樞感覺神經(jīng)元中，其作為電化學(xué)傳感器參與軀體和內(nèi)臟傷害感受。在外周水平，ASIC3在炎性疼痛中起重要作用，并且ASIC3還參與機械感覺及脊髓水平疼痛信號的傳遞和調(diào)節(jié)[32]。CSF-cNs對機械刺激和pH值降低均有反應(yīng)，這種效應(yīng)能夠被ASIC3阻斷劑消除，這表明CSF-cNs對機械刺激和pH值降低的感應(yīng)是通過ASIC3通道實現(xiàn)的[33-34]。

3 CSF-cNs的神經(jīng)干細胞特性

3.1CSF-cNs發(fā)育起源 一般來說，B1細胞是在胚胎期第13.5天到第15天之間由放射狀膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的[35]。有趣的是，CSF-cNs產(chǎn)生于胚胎期第12天至第22天，且絕大多數(shù)CSF-cNs產(chǎn)生于第14和15天。與其他脊髓神經(jīng)元相比，CSF-cNs的生成并不局限于特定的神經(jīng)上皮層，它甚至被認(rèn)為是在神經(jīng)源性晚期產(chǎn)生的[36]。在第13.5天 CSF-cNs前體細胞表達Ascl1，它控制著CSF-cNs和室管膜細胞之間的平衡。此外，CSF-cNs和神經(jīng)干細胞共享多種干細胞標(biāo)志物，如Nestin和Sox2。

早在2003年就有研究報道在大鼠脊髓中存在一個高度可塑性的GABA能 CSF-cNs群體，共同表達谷氨酸脫羧酶和多聚唾液酸化的神經(jīng)細胞黏附分子(PSA-NCAM)，而PSA-NCAM是細胞可塑性的標(biāo)志[37]。在七鰓鰻脊髓橫斷實驗中發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后中央管周圍有許多新形成的神經(jīng)元聚集，這種現(xiàn)象在脊髓橫斷7周后仍然存在，且據(jù)推測，這些新生神經(jīng)元可能是CSF-cNs[38]。類似的現(xiàn)象在鰻魚中也有報道[39]。CSF-cNs在小鼠脊髓中表達HUC/D神經(jīng)元蛋白、Doublecortin和PSA-NCAM，但不表達神經(jīng)元特異性核蛋白。這些未成熟神經(jīng)元表現(xiàn)出電生理特性，從緩慢的鈣離子介導(dǎo)反應(yīng)到快速重復(fù)的鈉離子峰，這表明它們處于不同的成熟階段[1,18,25]。此外，PKD2L1+CSF-cNs還表達轉(zhuǎn)錄因子Nkx6.1，這是一種包含同源結(jié)構(gòu)域的蛋白，可將腹側(cè)祖細胞分化為體細胞運動神經(jīng)元和中間神經(jīng)元[40]。然而，CSF-cNs表達雙皮質(zhì)蛋白和Nkx6.1，這是2種未成熟神經(jīng)元的標(biāo)志物，這種表型在12個月大的動物中持續(xù)存在。表明CSF-cNs的持續(xù)成熟發(fā)生在出生后，這些CSF-cNs保持著持續(xù)的低分化狀態(tài)[26]。

3.2CSF-cNs和神經(jīng)干細胞池 在成年哺乳動物大腦中，神經(jīng)干細胞至少存在于3個主要的生發(fā)區(qū)：海馬齒狀回顆粒下區(qū)、側(cè)腦室室管膜下區(qū)和脊髓中央管小生境，越來越多的研究證實了這一點[41]。這些成熟神經(jīng)干細胞在一生中不斷產(chǎn)生功能性神經(jīng)元，這一代神經(jīng)干細胞被認(rèn)為對嗅覺、學(xué)習(xí)和記憶等生物功能至關(guān)重要。在創(chuàng)傷性腦損傷等病理條件下，神經(jīng)干細胞的增殖和神經(jīng)發(fā)生增加，生成新的神經(jīng)細胞遷移到損傷部位并替換受損神經(jīng)元。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，脊髓中央管細胞至少可區(qū)分出3種不同的細胞類型：多纖毛型室管膜細胞，基底突短，與鄰近神經(jīng)組織接觸；單纖毛型室管膜細胞，呈典型的放射狀膠質(zhì)形態(tài)；CSF-cNs，直接接觸腦脊液的雙極細胞，這些細胞的一側(cè)突出與腦脊液連接，而另一側(cè)與脊髓實質(zhì)連接，從而形成“腦-腦脊液屏障”。雖然室管膜細胞曾被認(rèn)為是脊髓中的神經(jīng)干細胞[42]，然而單細胞RNA-seq顯示室管膜細胞富集的纖毛相關(guān)基因共享幾個干細胞相關(guān)基因。此外，在體內(nèi)和體外暴露于神經(jīng)干細胞或祖細胞刺激環(huán)境下的室管膜細胞不表現(xiàn)出任何潛在的神經(jīng)干細胞功能[43]。值得注意的是，CSF-cNs不僅存在于哺乳動物的中縫背核、下丘腦和大腦的其他區(qū)域，而且在脊髓中央管中強烈富集[44]。

3.3CSF-cNs神經(jīng)干細胞潛能和脊髓損傷修復(fù) 眾所周知，脊髓損傷是神經(jīng)外科領(lǐng)域最具破壞性的疾病之一。脊髓損傷患者通常會失去自理能力，在生理和心理上承受著巨大的痛苦，并給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。即使有最好的藥物、手術(shù)和康復(fù)治療，許多患者仍然不得不面對嚴(yán)重的神經(jīng)后遺癥。20世紀(jì)90年代初，在包括人類在內(nèi)的哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了成體神經(jīng)干細胞，這為通過刺激這些細胞進行自我再生來治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的可能性[42,45]。脊髓損傷促進了神經(jīng)球形成的增加，使神經(jīng)干細胞的數(shù)量顯著增加，神經(jīng)干細胞可以為脊髓損傷微環(huán)境提供軸突營養(yǎng)支持，并可增強血管形成、改變炎癥反應(yīng)和防止囊性變化，從而促進運動功能的恢復(fù)[46]。然而，脊髓中央管內(nèi)神經(jīng)干細胞的身份仍有爭議。先前的一項研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細胞位于室管膜細胞中，故可以作為脊髓損傷后的細胞移植[47]。然而，另一項研究未能證實室管膜細胞具有神經(jīng)干細胞功能[43]。因此，脊髓中央管內(nèi)神經(jīng)干細胞的鑒定對于脊髓損傷的治療至關(guān)重要。相比之下，CSF-cNs的潛在神經(jīng)干細胞特性將為脊髓損傷患者帶來新的治療曙光，可以想象CSF-cNs將在脊髓損傷的治療中發(fā)揮積極作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷動物模型中，經(jīng)側(cè)腦室注射外源性細胞生長因子可以激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞發(fā)生增殖和遷移，促進損傷脊髓組織的修復(fù)[48]。有研究人員通過將霍亂毒素亞單位B-辣根過氧化物酶復(fù)合體注入大鼠側(cè)腦室以標(biāo)記遠位觸液神經(jīng)元，并注入霍亂毒素B與皂苷耦聯(lián)以破壞這些細胞，在注射第14天建立脊髓損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)破壞CSF-cNs后會使脊髓損傷大鼠的內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞群體數(shù)量減少，同時延長了術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)的時間[49]。由此推測CSF-cNs可能是內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的來源之一，并可能參與脊髓損傷后的神經(jīng)恢復(fù)。WANG等[50]通過流式細胞術(shù)分離純化CSF-cNs，分別貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)，檢測神經(jīng)干細胞標(biāo)志物表達。免疫熒光染色表明，由PKD2L1+CSF-cNs形成的神經(jīng)球表達神經(jīng)干細胞標(biāo)志物巢蛋白、Sox2和GFAP，并且這些神經(jīng)球還具有通過體外培養(yǎng)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力。這也表明CSF-cNs是未成熟的神經(jīng)元細胞，具有神經(jīng)干細胞的特性，可以增殖和分化為其他神經(jīng)細胞[46]。因此，深入研究CSF-cNs增殖和分化的分子機制將有助于開發(fā)CSF-cNs治療脊髓損傷的潛力。

4 展望

目前，專門研究CSF-cNs的科學(xué)文獻越來越多，突出了這一細胞群在治療脊髓疾病中的關(guān)鍵作用。其與腦脊液密切接觸的性質(zhì)使得針對性的鞘內(nèi)治療成為一種可行的選擇。雖然CSF-cNs的研究在發(fā)現(xiàn)特定標(biāo)志物PKD2L1后進展迅速，但CSF-cNs在體外表現(xiàn)出的神經(jīng)干細胞特性機制仍不清楚，現(xiàn)在CSF-cNs可分為2個具有不同特性的群體，哪一個CSF-cNs群體擁有神經(jīng)干細胞特性,CSF-cNs在脊髓損傷狀態(tài)下究竟如何轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細胞，又如何進行增殖并分化為其他神經(jīng)細胞，增殖和分化的神經(jīng)細胞如何到達損傷部位，以及修復(fù)損傷部位的機制仍不清楚，未來需繼續(xù)關(guān)注促進CSF-cNs在脊髓損傷時的激活和分化的相關(guān)分子機制或物理因素等的探索，并應(yīng)致力于進一步定義脊髓損傷后該細胞群的作用。