精神壓力-應(yīng)激動物模型的建立及行為學(xué)評價

董星明，陳 柯，善孝勝，李慶亮，張兆元，馬茜鈺，張 錦

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)二科 261000；3.濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；5.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，蘭州 730000)

隨著當(dāng)前社會生活節(jié)奏加快、社會競爭加劇，長期的精神壓力大、超負(fù)荷工作、生活作息紊亂等問題越來越突出，共同構(gòu)成了人們承受的不良應(yīng)激因素，導(dǎo)致既往無心腦血管疾病史的人群猝死發(fā)生率明顯增加。健康人群猝死現(xiàn)象成為醫(yī)學(xué)界和法律學(xué)界關(guān)注的焦點。因此，筆者提出，上述這些因素均可作為應(yīng)激源，刺激機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，從而引起機體損傷，故將上述過程稱為精神壓力-應(yīng)激。

大量研究發(fā)現(xiàn)，長期在應(yīng)激狀態(tài)下會影響身心健康、生活質(zhì)量和工作效率，嚴(yán)重時引起精神心理性疾病或心腦血管等軀體性疾病，甚至發(fā)生猝死[1-3]。有研究探討每周工作時間和輪班工作與慢性疾病之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在患慢性疾病的工人中，每周工作時間超過40 h和輪班工作與血糖、血壓、血脂等臨床測定指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)[4]。CHANG等[5]發(fā)現(xiàn)，壓力性生活事件，尤其是那些產(chǎn)生慢性壓力的事件，可能會使原本健康的個體更易患致命性心律失常，而導(dǎo)致猝死的發(fā)生。還有研究顯示，2008—2018年，中國共有107位醫(yī)生因過度勞累而猝死在工作崗位上，平均年齡(39.67±9.46)歲，其中男性占比88.57%[6]。中青年人群中猝死現(xiàn)象的高發(fā)成為社會關(guān)注的焦點。應(yīng)激不僅是多種疾病的促發(fā)因素，還是引起器官損傷的重要原因，其中，心、腦和血管是應(yīng)激的主要靶器官。由應(yīng)激導(dǎo)致的猝死可能與精神壓力-應(yīng)激密切相關(guān)，但其機制尚不清楚。因此，本研究擬通過建立精神壓力-應(yīng)激大鼠模型，探討精神壓力-應(yīng)激相關(guān)性疾病發(fā)病機制，為防治精神壓力-應(yīng)激引起的心肌損傷及猝死發(fā)生提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

80只無特殊病原體(SPF)級健康成年雄性SD大鼠，體重250～300 g，購于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SYXK(甘)2013-003，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院SPF級動物實驗室。動物飼養(yǎng)溫度(23±3)℃，相對濕度40%～70%，光照時間07:00-19:00。本研究經(jīng)蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，操作符合醫(yī)學(xué)實驗動物的保護原則。

1.2 方法

1.2.1動物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對大鼠進行稱重，并進行糖水偏好實驗和曠場實驗測定，將80只大鼠分為對照組(2、4、8、12周)和模型組(2、4、8、12周)，每組各10只。

1.2.2動物模型建立

精神壓力-應(yīng)激動物模型的構(gòu)建參考文獻[7]并加以改進，對照組5只/籠正常飼養(yǎng)，模型組采用單籠飼養(yǎng)結(jié)合每天3種不可預(yù)知性刺激的方法建立動物模型，共13種不可預(yù)知性刺激，模型組分別接受的應(yīng)激時長為2、4、8、12周，具體方案如下：(1)禁食24 h；(2)禁水24 h；(3)晝夜顛倒各12 h；(4)夾尾2 min；(5)潮濕墊料24 h；(6)空籠24 h；(7)4 ℃冰水游泳7 min；(8)束縛2 h；(9)閃光2 h；(10)空水瓶暴露2 h；(11)傾斜45° 12 h；(12)徹夜光照12 h；(13)25 ℃水強迫游泳20 min。

1.2.3一般情況觀察

每天觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、毛發(fā)情況、運動狀態(tài)、抓取時掙扎程度、對刺激反應(yīng)情況及大小便情況等。

1.2.4體重變化測定

相同時間段內(nèi)對實驗前后大鼠進行稱重，監(jiān)測實驗期間模型組和對照組體重變化并記錄每周末的體重，以實驗前體重作為基線水平，計算分析大鼠體重變化情況。體重變化率(%)=(建模期體重—基線體重)/基線體重×100%。

1.2.5糖水偏好實驗

參考文獻[8]進行操作，測定2 h內(nèi)大鼠對1%蔗糖水的消耗百分比。具體方法如下：所有大鼠單籠飼養(yǎng)，自由飲用兩瓶1%蔗糖水24 h，隨后自由飲用1%蔗糖水和純水24 h，禁食水24 h后給予1瓶1%蔗糖水和1瓶純水，期間調(diào)換2瓶水的位置，飲用2 h后撤掉瓶子。稱量并記錄蔗糖水和純水的消耗量，計算糖水偏好率。糖水偏好率(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.2.6曠場實驗

參考文獻[9]并進行測定。實驗開始時將大鼠放在長寬高為60 cm×60 cm×40 cm的正方形曠場箱中，箱底由9個20 cm×20 cm等大的方格組成，中央上方安置攝像頭，記錄大鼠5 min內(nèi)的活動情況。觀察和分析指標(biāo)包括：(1)水平運動評分，即穿越方格數(shù)，以四爪完全進入下一格為標(biāo)準(zhǔn)，每穿越1格計1分；(2)垂直運動評分，即站立的次數(shù)，以大鼠前肢同時騰空>1 cm或攀附箱壁為標(biāo)準(zhǔn)，每次站立計1分。曠場實驗評分=水平運動評分+垂直運動評分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài)觀察

實驗前，兩組大鼠性格溫順，皮膚毛發(fā)柔順有光澤，體型正常，進食飲水正常，睡眠質(zhì)量好。實驗后2周，模型組大鼠表現(xiàn)為易驚醒、淺睡眠、煩躁不安、警覺性增加、攻擊性增強等易激惹狀態(tài)，隨著精神壓力-應(yīng)激時間的增加，逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、興趣喪失等淡漠抑制狀態(tài)，伴有皮膚毛發(fā)暗淡無光、進食飲水減少、運動減少、腹型肥胖、體型瘦小等表現(xiàn)。

2.2 體重變化測定

實驗前，兩組體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗后，兩組體重均有不同程度增加，模型組體重始終低于對照組(P<0.05)，且隨著建模時間的延長，這種差異越來越明顯；自實驗后4周，模型組體重在一定范圍內(nèi)波動，不再出現(xiàn)明顯的增減，見表1、圖1。

表1 兩組大鼠體重比較

aP<0.05，與對照組比較。圖1 大鼠體重變化情況

2.3 糖水偏好率

實驗后2周，與對照組比較，模型組糖水偏好率降低(P<0.05)，且這種差異在整個實驗期間持續(xù)存在，隨著精神壓力-應(yīng)激時間的延長，模型組糖水偏好率逐漸降低，而對照組糖水偏好率無明顯變化，見圖2。

aP<0.05，與對照組比較。圖2 糖水偏好率

2.4 曠場實驗活動評分

實驗后2周，模型組水平運動評分、垂直運動評分及曠場實驗活動評分降低，但兩組曠場實驗行為學(xué)表現(xiàn)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗后4、8周，模型組水平運動評分、垂直運動評分及曠場實驗活動評分明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著實驗時間延長至12周時，模型組大鼠活動進一步減少，水平運動評分、垂直運動評分及曠場實驗活動評分降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：水平運動評分；B：垂直運動評分；C：曠場實驗活動評分；a：P<0.05，與對照組比較。圖3 曠場實驗結(jié)果

3 討 論

由于社會發(fā)展轉(zhuǎn)型，每個人扮演著多重身份和角色，壓力或應(yīng)激充斥在每個人的生活和工作中。然而在強烈、長期的壓力或應(yīng)激狀態(tài)下，人們的行為會產(chǎn)生病理性改變，對機體產(chǎn)生不利影響。除了吸煙、飲酒、糖尿病、高血壓等心腦血管傳統(tǒng)危險因素外，焦慮抑郁等精神心理壓力和社會生活壓力等也可作為應(yīng)激原的重要組成部分參與高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心律失常等心血管疾病的發(fā)生[10-11]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，在長期應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system,SNS)、下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA)等會過度激活，一方面可以引起血液中兒茶酚胺水平的增加，對心腦血管產(chǎn)生持續(xù)激動作用，從而導(dǎo)致血壓升高、心率增快，且產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，造成血管內(nèi)皮損傷[12]；另一方面，還可以引起糖皮質(zhì)激素的大量釋放，使脂肪分解增多，誘發(fā)高脂血癥。此外，糖皮質(zhì)激素還可以增加血管對兒茶酚胺的反應(yīng)性，進一步加劇血管內(nèi)皮的損傷[13-14]?；谏鲜鲅芯坷碚?，為了最大程度模擬人們在生活中遇到的各種不良精神壓力、生活習(xí)慣，使其更符合研究者所提出的精神壓力-應(yīng)激概念，從而建立精神壓力-應(yīng)激大鼠模型。

SD大鼠是生物行為和藥理學(xué)研究中使用最廣泛的品系，由于其神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，垂體-腎上腺系統(tǒng)功能發(fā)達，被廣泛應(yīng)用于認(rèn)知記憶、獎賞機制等高級神經(jīng)活動的研究[15]。此外，此種屬還有獲取方便、重復(fù)性好、模擬性好等特點。故本實驗選擇SD大鼠作為研究對象。

當(dāng)前，研究應(yīng)激的模型包括慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)、社會失敗應(yīng)激(social defeat stress,SDS)、早期應(yīng)激(early life stress,ELS)、給藥等多種方式[16]。在本實驗?zāi)Ｐ脱芯恐?，為最大程度模擬當(dāng)今社會高競爭、超時工作、生活作息紊亂、焦慮抑郁等精神壓力-應(yīng)激狀態(tài)，通過適當(dāng)增加建模時間與刺激種類，對目前存在的動物模型進行改良，建立精神壓力-應(yīng)激大鼠模型。觀察大鼠一般狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在建模的早期(2周)，模型組表現(xiàn)出攻擊性增強、煩躁不安等激惹狀態(tài)，隨著建模時間的增加，逐漸出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、興趣喪失等淡漠抑制狀態(tài)，這與MATISZ等[17]研究結(jié)果類似。模型組狀態(tài)的變化可能與血漿中激素變化有關(guān)，早期兒茶酚胺水平升高，對機體產(chǎn)生興奮作用，隨著應(yīng)激時間的延長，長期高濃度的兒茶酚胺對心肌產(chǎn)生損傷[18]。此外ROSTAMKHANI等[19]發(fā)現(xiàn)在急性應(yīng)激狀態(tài)下，應(yīng)激組血漿皮質(zhì)醇水平明顯增加，在慢性應(yīng)激下，應(yīng)激組皮質(zhì)醇水平明顯低于對照組。

從體重變化來看，各組體重均有一定的增加，模型組增加程度明顯低于對照組，從建模4周開始，模型組體重不再出現(xiàn)明顯的變化。有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠的體重變化與刺激的強度、類型、持續(xù)時間等有關(guān)[19]。LPEZ等[20]發(fā)現(xiàn)在給予大鼠不同刺激40 d后，實驗組大鼠出現(xiàn)體重的明顯減低，并推測可能與擾亂大鼠碳水化合物、脂質(zhì)及激素的代謝過程相關(guān)。精神壓力-應(yīng)激狀態(tài)影響糖脂代謝導(dǎo)致體重增加緩慢，另一方面可以使交感神經(jīng)過度興奮，能量消耗增加、攝入減少導(dǎo)致體重增長受到抑制。

糖水偏好率可以反映動物對愉快感的體驗程度和獎賞性事件的反應(yīng)程度。本實驗采用雙瓶水來測定，預(yù)先進行蔗糖水適應(yīng)，結(jié)合測定前禁食禁水狀態(tài)，可以明顯地比較出不同狀態(tài)下快感的缺乏程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，自建模2周開始，模型組糖水偏好率明顯降低(P<0.05)，且隨著建模時間的延長，與對照組相比降低更加明顯。在曠場實驗中，水平運動距離反映大鼠活動度的情況，垂直活動反映對新環(huán)境的好奇程度。通過評估曠場實驗活動情況，能夠測定出大鼠在新環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度[22]。在本研究中，重點測定了水平運動格數(shù)和垂直站立次數(shù)，發(fā)現(xiàn)建模2周時，曠場實驗活動評分無明顯差異，自建模4周開始，模型組曠場實驗活動評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著建模時間的延長，這種差異更加的明顯。說明隨著應(yīng)激時間的延長，自發(fā)運動能力在環(huán)境壓力超過其承受能力時才出現(xiàn)明顯的減弱。

綜上所述，在精神壓力-應(yīng)激概念的基礎(chǔ)上，本研究采用每天給予大鼠3種不可預(yù)知刺激與孤養(yǎng)的方法建立精神壓力-應(yīng)激大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在體重、行為學(xué)等方面與對照組相比出現(xiàn)了差異性改變，表明本研究建立的精神壓力-應(yīng)激大鼠模型是成功的，可以作為研究精神壓力-應(yīng)激相關(guān)性疾病的動物模型。