hsa_circ_0000073對(duì)骨肉瘤脂質(zhì)代謝的影響

任智晶，楊 震，楊 丹，田曉濱

(1.貴州省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科，貴陽(yáng) 550002；2.貴州省人民醫(yī)院骨科，貴陽(yáng) 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴陽(yáng) 550000)

骨肉瘤是一種來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的惡性腫瘤，年發(fā)病率為1/100萬(wàn)～4/100萬(wàn)，5年生存率為37.5%～77.6%[1-5]，了解骨肉瘤致病過(guò)程中的分子機(jī)制將有助于促進(jìn)和發(fā)展更有效的治療策略。最近的研究發(fā)現(xiàn)，能量代謝的重編程被認(rèn)為是惡性轉(zhuǎn)化的標(biāo)志[6]。其中，脂質(zhì)代謝失調(diào)在癌癥進(jìn)展中具有至關(guān)重要的作用，靶向脂質(zhì)代謝已被視為一種新的腫瘤治療策略[7-10]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類(lèi)非編碼RNA，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力、細(xì)胞周期、凋亡及自噬等密切相關(guān)[11-13]。同時(shí)，circRNA也被證實(shí)可以參與調(diào)控腫瘤的脂質(zhì)代謝[14-15]。本課題組前期研究證實(shí)了hsa_circ_0000073在骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，并可促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。然而hsa_circ_0000073是否可以影響骨肉瘤細(xì)胞代謝，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)研究報(bào)道。因此，本研究旨在探索hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞及裸鼠異種移植瘤體中脂質(zhì)代謝的影響，以期為骨肉瘤的診斷和治療提供潛在的靶點(diǎn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1骨肉瘤組織標(biāo)本

收集2020年1月至2022年1月貴州省人民醫(yī)院就診且經(jīng)病理證實(shí)的10例骨肉瘤患者的腫瘤組織和癌旁組織。10例患者中男6例，女4例；年齡>18歲2例，<18歲8例；均無(wú)高血壓、糖尿病等其他基礎(chǔ)疾病。本研究經(jīng)過(guò)貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫預(yù)審(2019)030]，所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.1.2動(dòng)物與細(xì)胞

12只BALB/C-nu小鼠購(gòu)自西普爾-比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技公司，4周齡，平均體重約15 g，分為兩組，每組6只。骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和Saos-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3試劑與儀器

引物、shRNA(安徽通用生物有限公司)，MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，McCoy’s 5a培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，LipofectamineTM3000(美國(guó)Thermo公司)，TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，油紅O染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，尼羅紅熒光染色溶液(上海源葉生物科技有限公司)，Gene Chip miRNA Array 4.0(美國(guó)Affymetrix公司)，熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(杭州博日科技股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)，自動(dòng)酶標(biāo)儀(中安生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分組

根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染hsa_circ_0000073或隨機(jī)序列的shRNA，分為circ_0000073干擾組及對(duì)照組。

1.2.2qRT-PCR

使用Trizol作為總RNA的抽提試劑。采用酸性酚-氯仿混合液純化RNA，異丙醇沉淀濃縮，乙醇洗滌沉淀。PrimeScript RTase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR試劑盒用于qRT-PCR檢測(cè)，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)操作。使用GAPDH的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并按公式2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 qRT-PCR所使用引物序列

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建

MG-63和Saos-2骨肉瘤細(xì)胞在含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清。使用LipofectamineTM3000將sh-NC(隨機(jī)序列的sh-RNA，對(duì)照)及sh-hsa_circ_0000073轉(zhuǎn)染細(xì)胞，shRNAs序列見(jiàn)表2。48 h后加入500～800 μg/mL G418進(jìn)行篩選。4周后，加入200～300 μg/mL G418維持培養(yǎng)。由于載體中帶有綠色熒光蛋白，成功轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞在熒光顯微鏡中會(huì)呈現(xiàn)綠色熒光。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞熒光顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光后，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率。

表2 shRNA序列

1.2.4基因表達(dá)譜分析和生物信息學(xué)分析

為了揭示hsa_circ_0000073在骨肉瘤中的作用及其機(jī)制，本研究使用了表達(dá)譜芯片對(duì)干擾hsa_circ_0000073后的差異基因進(jìn)行篩選，并將篩選結(jié)果通過(guò)生物信息學(xué)方法進(jìn)行富集分析。具體方法如下：細(xì)胞轉(zhuǎn)染sh-NC或sh-hsa_circ_0000073，使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。使用GeneChip WT Pico Reagent Kit檢測(cè)基因表達(dá)譜，以FC>1.5為條件篩選差異表達(dá)基因。使用GO分析對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，設(shè)置條件為：p.adj<0.05和q value<0.2。R語(yǔ)言(3.6.3版本)的“clusterProfiler”包用于數(shù)據(jù)分析，“ggplot2”包用于數(shù)據(jù)可視化。

1.2.5油紅染色

為了探索hsa_circ_0000073對(duì)骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究進(jìn)行了油紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)情況。細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入12孔板，適宜條件下生長(zhǎng)48 h，各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，加入3 mg/mL油紅染液于室溫下染色30 min，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，異丙醇提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.2.6尼羅紅熒光染色

由于不同實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度及特異度不同，為了進(jìn)一步驗(yàn)證hsa_circ_0000073對(duì)骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究還使用了尼羅紅熒光染色實(shí)驗(yàn)對(duì)油紅染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。各組細(xì)胞計(jì)數(shù)后適宜條件下培養(yǎng)，脂肪固定液固定24 h，1 mg/mL尼羅紅染色用PBS 1∶500稀釋成工作液，滴加到細(xì)胞爬片上，37 ℃下染色30 min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并測(cè)定熒光強(qiáng)度。

1.2.7裸鼠異種移植實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證hsa_circ_0000073對(duì)在體生長(zhǎng)的骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，本研究使用了BALB/C-nu小鼠側(cè)腋注射2×107個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞。適宜條件下飼養(yǎng)5周后，處死小鼠，將瘤體冰凍切片后進(jìn)行油紅和尼羅紅染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織和癌旁組織的表達(dá)情況

hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

aP<0.05。圖1 hsa_circ_0000073在骨肉瘤組織和癌旁組織的表達(dá)情況

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建情況

通過(guò)G418篩選后，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大部分細(xì)胞在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光。與對(duì)照組比較，circ_0000073干擾組hsa_circ_0000073表達(dá)水平降低(P<0.05)，提示sh-NC和sh-hsa_circ_0000073的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株建立成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2～3。

圖2 熒光顯微鏡觀察結(jié)果

aP<0.05。圖3 sh-hsa_circ_0000073相對(duì)表達(dá)水平

2.3 干擾hsa_circ_0000073后的基因表達(dá)譜分析

干擾hsa_circ_0000073后，MG-63細(xì)胞和Saos-2細(xì)胞中分別有1 838和1 255個(gè)下調(diào)基因。通過(guò)韋恩分析，共篩選出398個(gè)共同下調(diào)的差異基因。GO分析結(jié)果顯示這398個(gè)差異基因主要富集于有絲分裂核分裂、紡錘體、染色體、著絲粒區(qū)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)“代謝通路”是兩種細(xì)胞干擾hsa_circ_0000073后富集到的主要通路，見(jiàn)圖4～5。

圖4 差異基因的 GO富集分析

圖5 KEGG通路分析

2.4 hsa_circ_0000073可影響骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝

與對(duì)照組比較，circ_0000073干擾組骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)減少，吸光度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6～7。與對(duì)照組比較，circ_0000073干擾組骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)尼羅紅熒光強(qiáng)度減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖8～9。

A：兩組油紅染色圖片；B：兩組脂質(zhì)相對(duì)水平比較；a：P<0.05。圖6 MG-63骨肉瘤細(xì)胞油紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：兩組油紅染色圖片；B：兩組脂質(zhì)相對(duì)水平比較；a：P<0.05。圖7 Saos-2骨肉瘤細(xì)胞油紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：兩組尼羅紅染色圖片；B：兩組尼羅紅熒光相對(duì)強(qiáng)度比較；a：P<0.05。圖8 MG-63骨肉瘤細(xì)胞尼羅紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：兩組尼羅紅染色圖片；B：兩組尼羅紅熒光相對(duì)強(qiáng)度比較；a：P<0.05。圖9 Saos-2骨肉瘤細(xì)胞尼羅紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 hsa_circ_0000073可影響裸鼠異種移植瘤中骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝

裸鼠移植瘤體組織的油紅和尼羅紅染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，circ_0000073干擾組脂質(zhì)減少，熒光強(qiáng)度減弱，提示干擾hsa_circ_0000073可以降低在體骨肉瘤細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，見(jiàn)圖10～11。

圖10 裸鼠異種移植油紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖11 裸鼠異種移植尼羅紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

最近的研究發(fā)現(xiàn)，能量代謝重編程是由基因組不穩(wěn)定性引起的腫瘤標(biāo)志[6]。脂質(zhì)作為重要的信號(hào)分子、維持結(jié)構(gòu)完整性和儲(chǔ)存能量的細(xì)胞成分，經(jīng)常在癌癥狀態(tài)下重新編程[17]。例如，腫瘤細(xì)胞中脂質(zhì)代謝酶的表達(dá)及活性改變，內(nèi)源性脂肪酸合成激活，脂肪動(dòng)員異常等，均可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝失調(diào)，幫助腫瘤細(xì)胞以脂質(zhì)為原料維持其快速增殖和轉(zhuǎn)移行為，或促進(jìn)異常的癌細(xì)胞-基質(zhì)細(xì)胞通信，觸發(fā)致癌信號(hào)以促進(jìn)生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致疾病進(jìn)展[7-9]。在骨肉瘤中，有研究者以高通量的方式研究了轉(zhuǎn)移性(143B)和非轉(zhuǎn)移性(HOS)骨肉瘤細(xì)胞與正常胎兒成骨細(xì)胞(FOB)的總體脂質(zhì)代謝差異，發(fā)現(xiàn)許多脂質(zhì)種類(lèi)在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移中存在較大差異[17]。而另一項(xiàng)研究報(bào)道，抑制脂肪酸合酶(FASN)可通過(guò)下調(diào)HER2/PI3K/AKT信號(hào)通路活性影響骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18]。因此，靶向脂質(zhì)代謝等代謝途徑可能將有助于發(fā)展現(xiàn)有的骨肉瘤治療策略。

circRNA是一種共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。由于缺乏3′端多聚腺苷酸化尾及5′端帽結(jié)構(gòu)，circRNA可以避免外切核酸酶降解，半衰期較長(zhǎng)，具有臨床應(yīng)用的潛能[19]。越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的脂質(zhì)代謝。例如，在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)物和肝組織中，circRNA_0046367表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與甘油三酯水平呈負(fù)相關(guān)[20]。另一則研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，circRNA_0057558的表達(dá)與前列腺癌患者的甘油三酯水平呈正相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平以促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展[21]。在機(jī)制上，circGFRA1被證實(shí)可通過(guò)ceRNA機(jī)制促進(jìn)GFRA1的表達(dá)，從而誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞中脂質(zhì)改變[22]。而肺腺癌中高表達(dá)的circFARSA也被發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)miR-330-5p和miR-326與FASN相互作用影響腫瘤進(jìn)展[14]。

本課題組前期研究分析了來(lái)自基因表達(dá)匯編(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)GSE96964 circRNA芯片數(shù)據(jù)，從中篩選出了hsa_circ_0000073作為目標(biāo)分子，并證實(shí)了其在骨肉瘤細(xì)胞系中高表達(dá)[16]。該芯片數(shù)據(jù)是2017年LIU等[23]為了將人骨肉瘤細(xì)胞系與人成骨細(xì)胞hFOB1.19(對(duì)照)中的circRNA表達(dá)進(jìn)行比較分析所獲得的circRNA表達(dá)譜。自從該數(shù)據(jù)上傳GEO數(shù)據(jù)庫(kù)以來(lái)，已被多名研究者下載使用，并從中篩選出了多個(gè)對(duì)骨肉瘤進(jìn)程具有重要作用的circRNA，為骨肉瘤的診斷和治療研究提供了幫助[24-25]。

本文在前期研究的基礎(chǔ)上收集了10例骨肉瘤患者及其癌旁組織標(biāo)本，通過(guò)qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000073在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，該結(jié)果與LI等[26]報(bào)道一致。為進(jìn)一步研究hsa_circ_0000073在骨肉瘤中的作用，本研究使用了Affymetrix基因芯片分析干擾hsa_circ_0000073后的基因表達(dá)譜改變?？紤]到生物信息學(xué)方法對(duì)于處理和分析大量信息至關(guān)重要，本研究首先將基因芯片獲得的差異基因進(jìn)行了GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的差異基因主要富集于有絲分裂核分裂、紡錘體、染色體、著絲粒區(qū)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)“代謝通路”是兩種細(xì)胞干擾hsa_circ_0000073后富集到的主要通路。提示hsa_circ_0000073的功能可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化有關(guān)，尤其與細(xì)胞代謝關(guān)系密切。隨后，通過(guò)骨肉瘤細(xì)胞和裸鼠異種移植瘤雙重模型，證實(shí)了hsa_circ_0000073對(duì)骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響，提示hsa_circ_0000073可能通過(guò)影響骨肉瘤細(xì)胞脂質(zhì)代謝促進(jìn)骨肉瘤進(jìn)展。

綜上所述，hsa_circ_0000073在腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織。通過(guò)基因芯片、生物信息學(xué)分析，表明hsa_circ_0000073的功能可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化有關(guān)，尤其與細(xì)胞代謝關(guān)系密切。隨后的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了干擾hsa_circ_0000073可以影響骨肉瘤細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，該發(fā)現(xiàn)為骨肉瘤的診斷和治療提供了新的思路，豐富了骨肉瘤發(fā)病機(jī)制的理論依據(jù)。然而，盡管有初步的證據(jù)表明hsa_circ_0000073在調(diào)節(jié)骨肉瘤脂質(zhì)代謝中具有重要作用，但未來(lái)仍需納入更多的臨床相關(guān)性研究，同時(shí)還需要深入探討hsa_circ_0000073影響骨肉瘤脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制，以期為相應(yīng)分子的轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。