不同F(xiàn)SH處理方法對多浪羊FSH、LH、E2和P4激素水平及發(fā)情的影響

牛志剛，呂松杰，丁煜恭，王新海，司衣提·克熱木，史洪才*

(1.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆烏魯木齊 830000；2.新疆五征綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，新疆麥蓋提844600；3.新疆喀什地區(qū)畜牧工作站，新疆喀什844000)

多浪羊是新疆喀什地區(qū)主要的綿羊品種，具有體型大、生長速度快、肉產(chǎn)量高、屠宰性能良好等特點。多浪羊可以全年舍飼，能適應(yīng)新疆南疆地區(qū)夏季干燥炎熱的環(huán)境，抗病力強(qiáng)，耐粗飼，能四季發(fā)情，且具有早熟性，是新疆優(yōu)良的地方品種[1-3]。促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)能促進(jìn)卵巢卵泡的生長、雌激素合成和分泌，促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增生和刺激卵泡細(xì)胞上促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)受體分化，其分泌方式受到下丘腦和性腺激素的調(diào)節(jié)，為脈沖式分泌。FSH控制顆粒細(xì)胞的發(fā)育、生長、成熟和類固醇生成，并在配子產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。在發(fā)情周期的適宜時間給予適量的外源FSH[5]，可以有效地增加卵巢的排卵。FSH在綿羊生產(chǎn)上是常見的促超數(shù)排卵藥物。多浪羊一般一胎產(chǎn)一只羔羊，平均產(chǎn)羔率約為107%，繁殖率較低，制約規(guī)模化養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益。利用外源激素對多浪羊?qū)嵤┩诎l(fā)情處理和高效繁殖，可以提高繁殖效率，降低生產(chǎn)成本，增加養(yǎng)殖效益。

前人研究表明，孕酮+PMSG+PG的同期發(fā)情方法，可以達(dá)到很好的發(fā)情效果；較小劑量的FSH可以刺激少量卵泡同時發(fā)育排卵，產(chǎn)較多數(shù)量的羔羊。FSH多用于綿羊超數(shù)排卵，而利用FSH不同注射方式提高多浪羊的繁殖效率的相關(guān)報道較少。該研究以多浪羊為試驗羊，在同期發(fā)情處理過程中注射150 IU的FSH，觀察不同的注射方法對激素水平及發(fā)情的影響。為進(jìn)一步提高多浪羊繁殖效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥品和器材。羊用孕酮海綿栓，新西蘭 Inter Greaulane 公司生產(chǎn)；注射用促卵泡素(規(guī)格為500 IU/支)、孕馬血清促性腺激素(規(guī)格為1 000 IU/支)、氯前列醇鈉(規(guī)格為0.2 mg/支)均由寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。多功能酶標(biāo)儀；美國Thereto Scientific公司；(FSH、LH、E2、P4)ELISA分析測定試劑盒；購自Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司；生理鹽水、乙醇、碘酒、高錳酸鉀粉、青霉素、鏈霉素、假陰道、集精杯、開膣器、輸精槍、顯微鏡、恒溫水浴鍋等均為國產(chǎn)。

1.1.2試驗羊。 2020年5月在新疆五征綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司開展試驗。母羊為2歲左右(172只)；種公羊為2歲以上，性欲旺盛，體型、外貌良好的成年公羊2只；試情羊選用有配種史、性欲旺盛的公羊5只。

1.2 方法

1.2.1試驗羊分組與同期發(fā)情處理。采用單因素設(shè)計，選經(jīng)過B超診斷未懷孕的試驗羊，設(shè)為A、B、C 3個試驗組和1個對照組D，在陰道中埋置1個孕酮海綿栓當(dāng)天記為第 0 天，第9天A、B、C組按不同的FSH注射方法進(jìn)行處理。A組10：00一次性注射FSH 150 IU；B組10：00注射100 IU FSH，8 h后再注射50 IU FSH；C組10：00注射75 IU FSH，8 h后再注射75 IU FSH；D對照組不注射FSH。4組第11天10：00撤栓時，肌肉分別注射PG 1 mL和PMSG 330 IU。

1.2.2發(fā)情鑒定。用試情公羊進(jìn)行試情。在08：00和20：00，將試情公羊放到母羊圈各試情1次，以母羊站立不動并接受爬跨為發(fā)情標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)試情3 d，在72 h內(nèi)發(fā)情視為同期處理有效，記錄每只羊從撤栓到發(fā)情的時間間隔。

1.2.3采精和人工授精。

(1)用假陰道法進(jìn)行采精。種公羊精液采出后，先通過肉眼觀察，為乳白有“云吞”狀的，在400×顯微鏡下對精液樣品進(jìn)行觀察，活率在0.8以上，密度達(dá)到“密”級，無異常氣味，色澤乳白的精液可用于人工輸精。

(2)精液稀釋配制。稱取葡萄糖 3 g、檸檬酸鈉 1.4 g，分別加入10萬IU青霉素和鏈霉素，溶解于100 mL滅菌水中，用0.22 μm的濾膜過濾。

(3)精液稀釋。將稀釋液和精液降至室溫。稀釋時根據(jù)所需輸精量，先進(jìn)行等倍稀釋，再加大稀釋倍數(shù)，該試驗稀釋倍數(shù)為4倍。

1.2.4人工授精。使用陰道開張器輸精，對有發(fā)情表現(xiàn)的母羊于發(fā)情后的12和24 h進(jìn)行2次人工授精，使用開張器，將輸精器插入子宮頸口內(nèi)0.5～1.0 cm輸入鮮精液0.1 mL。

1.2.5血樣采集。挑選發(fā)情的多浪羊母羊98只，其中A組25只，B組25只，C組25只，D組23只，每只母羊在注射FSH前、撤栓時、發(fā)情0 h和發(fā)情12 h 頸靜脈采集血樣 3 mL，室溫下靜置5～6 h，3 000 r/min 離心 15～20 min，分離上層血清移入1.5 mL 離心管中，放入-20 ℃儲存。

1.2.6激素測定。試驗?zāi)秆蜓宀捎妹嘎?lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定E2、FSH、LH和P4的濃度。根據(jù)ELISA試劑盒操作步驟測定，測定血清中 E2、FSH、LH和P4的含量，并以450 nm OD值為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出數(shù)值。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。應(yīng)用 SPSS 20.0(SPSS、Inc、Chicago、IL、USA)對激素水平、發(fā)情率數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 FSH不同處理方法對同期發(fā)情的影響統(tǒng)計4個試驗組4個時間點的發(fā)情母羊數(shù)，并計算撤栓后12～72 h總體的同期發(fā)情率，結(jié)果見表 1。

表1 FSH不同處理方法對多浪羊同期發(fā)情的影響

由表1可知，A、B、C組注射FSH后的發(fā)情率分別為77.78%、80.65%、87.50%，D對照組發(fā)情率為80.36%，統(tǒng)計分析顯示，4個組之間發(fā)情率差異不顯著(P>0.05)；但C組發(fā)情率高于其他組。

2.2 FSH不同處理方法對外周血液中生殖激素的影響

2.2.1不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中FSH濃度的比較。由表2可知，在FSH處理前、撤栓前、發(fā)情0 h和發(fā)情12 h時，各試驗組之間血清中FSH的濃度差異不顯著(P>0.05)；B、C、D組FSH濃度在發(fā)情0 h都出現(xiàn)了峰值。

表2 不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中FSH濃度的比較

2.2.2不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中E2濃度的比較。

由表3可知，在FSH處理前各試驗組之間血液中E2的濃度沒有顯著差異，在撤栓前B、C組顯著高于A、D組，在發(fā)情0 h時，B、C組極顯著高于A、D組，同時D組極顯著高于A組(P<0.01)，在發(fā)情12 h時，B、C、D組E2濃度顯著高于A組(P<0.05)。

表3 不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中E2濃度的比較

2.2.3不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中LH濃度的比較。由表4可知，F(xiàn)SH處理前和發(fā)情12 h時，各試驗組之間血液中LH的濃度沒有差異，撤栓前D組顯著高于A、B、C組(P<0.05)，在發(fā)情0 h時，B組顯著高于A、C、D組(P<0.05)。

表4 不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中LH濃度的比較

2.2.4不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中P4濃度的比較。由表5可知，在FSH處理前、撤栓前、發(fā)情0 h和發(fā)情12 h時，各試驗組之間血液中P4的濃度差異不顯著；B、C、D組的P4濃度峰值都出現(xiàn)在發(fā)情0 h時。

表5 不同F(xiàn)SH處理方法多浪羊血清中P4濃度的比較

3 討論

3.1 FSH不同處理方法對外周血液中生殖激素的影響FSH作用靶細(xì)胞是卵泡顆粒細(xì)胞，F(xiàn)SH使其增生，同時激活FSH受體細(xì)胞導(dǎo)致雄激素的合成，而雄激素是雌激素合成的重要前置物質(zhì)，因而FSH能夠提高雌激素的濃度。雌激素與FSH協(xié)同作用一方面增加顆粒細(xì)胞中LH受體的分化，另一方面又促進(jìn)顆粒細(xì)胞對雌激素的合成，形成一種良性循環(huán)。一般自然條件下綿羊發(fā)情是由于血清中E2濃度升高、P4濃度降低引起。

在卵泡周期募集期間，一群小卵泡對促性腺激素變得敏感并依賴于促性腺激素繼續(xù)生長發(fā)育[6]。引起卵泡周期募集的主要激素是FSH，發(fā)情周期中卵泡波的數(shù)量與FSH峰值的數(shù)量完全一致，這說明FSH峰是卵泡波出現(xiàn)的先決條件，用抑制素降低FSH的濃度，可以阻礙卵泡募集并推遲下個卵泡波的出現(xiàn)[7]。更多的卵泡同時發(fā)育需要人為地提高FSH濃度，雖然也需要基礎(chǔ)水平的LH，但LH脈沖在募集中沒有作用[8]。張振漢等[9]在灘羊試驗中，對產(chǎn)單、雙羔的母羊進(jìn)行分組，將LH、P4和E2進(jìn)行分析比較，雙羔組母羊在生殖周期中LH、P4和E2均顯著高于單羔組，其中E2在發(fā)情當(dāng)天處于高水平，隨后下降，這與該試驗B、C、D組結(jié)果一致；P4在發(fā)情當(dāng)天開始有所上升，與該試驗得出的在發(fā)情當(dāng)天上升后隨之下降有所不同；LH雙羔組峰值出現(xiàn)在發(fā)情當(dāng)天，且極顯著高于單羔組，與該試驗結(jié)果一致。常璐等[10]關(guān)于多浪羊同期發(fā)情試驗的數(shù)據(jù)顯示，E2在發(fā)情當(dāng)天出現(xiàn)峰值，與該試驗結(jié)果一致；P4、FSH和LH峰值出現(xiàn)在發(fā)情后12 h，與該試驗結(jié)果略有差異。

通過試驗結(jié)果可以看到，在使用FSH處理多浪羊之前采集的血清中FSH、E2、LH和P4的濃度在各試驗組之間差異不顯著，而E2在發(fā)情0 h時，B和C組極顯著高于A、D組(P<0.01)，D組極顯著高于A組。試驗除了FSH的處理方法不一樣，其他處理方式相同，試驗組之間出現(xiàn)差異，說明注射的150 IU FSH對多浪羊E2濃度在發(fā)情0 h時有影響，但在4個時間點都未觀察到FSH的濃度在試驗組與對照組之間有顯著差異，只在撤栓時A組高于其他3組，這與FSH的半衰期短有關(guān)，說明FSH不是直接對E2產(chǎn)生影響，而是作用于某一中間受體，可能是卵泡顆粒細(xì)胞，F(xiàn)SH使其增生，在PMSG和PG共同的作用下，造成B、C組與A、D組在發(fā)情0 h 時E2濃度的顯著差異。

A組與B、C、D組的E2和LH濃度相比，在一次性注射150 IU FSH后一直處在較低水平，可能是造成了負(fù)反饋調(diào)節(jié)，也可能是激素的峰值提前或后移未被檢測到。

3.2 生殖激素水平對發(fā)情率的影響將發(fā)情率和發(fā)情0 h時FSH、E2、LH和P4的濃度進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)，E2在發(fā)情0 h時，B、C組極顯著高于A、D組，D組極顯著高于A組；LH在發(fā)情0 h，B組顯著高于A、C、D組；A、B、C組注射FSH后的發(fā)情率分別為77.78%、80.65%、87.50%，對照組D組發(fā)情率為80.36%，統(tǒng)計分析顯示，4個組之間發(fā)情率差異不顯著(P>0.05)，但C組發(fā)情率高于其他組。B、C組的E2濃度相近，但是發(fā)情率C組高于B組，發(fā)情后C組的LH和P4的濃度要低于B組，可能是LH和P4參與了發(fā)情的催動，抑制了卵泡波的持續(xù)發(fā)生。

4 結(jié)論

外源生殖激素FSH的注射會對血液中 E2和LH的濃度造成影響，且發(fā)情0 h時血液中E2的濃度與發(fā)情率呈正相關(guān)。在發(fā)情0 h時出現(xiàn)A、B、C、D組的FSH峰值以及B、C、D組的LH、E2峰值，F(xiàn)SH和LH峰值的出現(xiàn)，為排卵前現(xiàn)象。一次性注射150 IU FSH可能會造成發(fā)情前、發(fā)情時、發(fā)情后的 E2和LH分泌的抑制，從而影響發(fā)情，考慮在以后試驗中單次FSH注射劑量不超過150 IU。75 IU+75 IU平均注射法對發(fā)情率有較好的作用；100 IU+50 IU遞減注射法，在發(fā)情0 h 可以明顯提高血液中E2和LH的濃度。