血管內(nèi)皮生長因子對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠缺氧及炎癥微環(huán)境的作用機制

陳 慧 劉艷玲 郎茂竹 吳儒佳 （貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，貴陽 550004）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）又被稱為內(nèi)異癥，是一種常見的婦科疾病，是子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在患者子宮以外的部位而導(dǎo)致的系統(tǒng)性疾病，以痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、性交疼痛、慢性盆腔痛等為主要臨床表現(xiàn)，另外EMs 是導(dǎo)致現(xiàn)代女性不孕的重要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量、身心健康和家庭幸福［1］。目前該病的主要治療方法為口服激素類藥物和手術(shù)，但是長期的藥物干預(yù)會影響患者的肝腎功能，以及導(dǎo)致患者出現(xiàn)更年期假絕經(jīng)表現(xiàn)，而手術(shù)治療后又極易復(fù)發(fā)［2］。因此深入揭示EMs的分子發(fā)展機制，尋找可靠的治療靶點，開發(fā)新型藥物或治療措施，在EMs 的臨床治療上具有重要意義。已有研究證實EMs 患者的病灶部位處于持續(xù)性的局部性缺氧、缺血、炎癥應(yīng)激等微環(huán)境中，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等調(diào)節(jié)因子被激活，促進(jìn)應(yīng)激級聯(lián)放大，最終導(dǎo)致異位內(nèi)膜細(xì)胞的浸潤以及增殖［3］。有研究證實EMs患者的病灶周圍出現(xiàn)大量的新生腹膜血管，血管新生為異位內(nèi)膜的黏附、定植以及生長提供足夠的物質(zhì)和能量［4］。血管內(nèi)皮生長 蛋 白 因 子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是機體內(nèi)血管生成的關(guān)鍵調(diào)控因子。張科群等［5］臨床研究結(jié)果顯示，抑制EMs 患者血清中VEGF 的表達(dá)，能明顯改善患者的臨床癥狀，緩解患者的痛經(jīng)情況。但是有關(guān)VEGF 對EMs缺氧以及炎癥微環(huán)境影響的報道較少。本研究通過自體內(nèi)膜移植構(gòu)建大鼠EMs 模型，探討VEGF 對疾病中缺氧以及炎癥微環(huán)境的影響，以期為新藥開發(fā)提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 40 只雌性未生育健康SD 大鼠， SPF 級，7～8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由北京北方艾特生物科技有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0005。在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后用于實驗。本研究已獲得貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 RNA 干擾VEGF（VEGF-siRNA）以及陰性對照VEGF-siRNA-NC 購自北京三元基因工程有限公司；苯甲酸雌二醇（1 ml∶2 mg，上海通用藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H31021114）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、組織裂解液（南京建成生物科技有限公司）；兔抗大鼠VEGF、HIF-1α、MPO 抗體（美國 Abcam 公司）；Western blot試劑盒、ELISA 試劑盒（北京中杉金橋有限公司）。

1.1.3 主要儀器 RM2235 超薄組織切片機（德國Leica 公司）；組織勻漿儀（德國IKA 公司）；超低溫冰箱（日本SANYO 公司）；光鏡（上海普赫光電科技有限公司）；JEOL-100CX透射電鏡（日本電氣公司）。

1.2 方法

1.2.1 EMs大鼠模型的復(fù)制［6］實驗大鼠術(shù)前48 h皮下注射4 mg/2 ml 的苯甲酸雌二醇以確保大鼠處在相同的動情周期，禁食不禁水12 h，以戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后，于腹部行縱切口，暴露右側(cè)子宮，結(jié)扎子宮兩端血管，分離子宮內(nèi)膜，將其修剪為4 mm×4 mm的片層結(jié)構(gòu)，并將該片層結(jié)構(gòu)縫合在左腹腸系膜血管豐富的部位，縫合傷口，腹腔注射硫酸慶大霉素，連續(xù)5 d 后，再次麻醉大鼠，在異位內(nèi)膜處可觀察到透明囊狀結(jié)構(gòu)，并且其表面有血管生成，內(nèi)里能觀察到積液，證明造模成功。

1.2.2 分組處理 實驗動物隨機分為假手術(shù)組、模型組、對照組和實驗組，每組10只，假手術(shù)組大鼠在造模過程中只進(jìn)行子宮內(nèi)膜截取，但不進(jìn)行內(nèi)膜移植，每日尾靜脈注射VEGF-siRNA-NC，模型組、對照組和實驗組大鼠進(jìn)行造模手術(shù)后，每組大鼠每日尾靜脈注射VEGF-siRNA-NC，實驗組大鼠每日尾靜脈注射VEGF-siRNA，每天注射1次，連續(xù)注射28 d。

1.2.3 各組大鼠血清指標(biāo)的檢測 在干預(yù)處理結(jié)束后，麻醉大鼠，腹主動脈采血5 ml，ELISA 檢測各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織病理學(xué)損傷 采血完畢，處死大鼠測量各組大鼠異位內(nèi)膜體積，無菌操作臺上，依次取材，分離各組大鼠的異位內(nèi)膜組織以及假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織；經(jīng)固定，脫水，包埋，切片，脫蠟，水化，蘇木精-伊紅染色（HE），鏡檢。

1.2.5 各組大鼠異位內(nèi)膜組織超微結(jié)構(gòu)改變 將各組大鼠的異位內(nèi)膜組織以及假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織于3%戊二醛中固定，1%鋨酸固定120 min，無水乙醇、丙酮梯度逐級脫水，包埋，洗滌，超薄切片，鈾-鉛雙染色，透射電鏡檢測。

1.2.6 樣本中差異基因的高通量測序 將假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織與模型組大鼠的異位內(nèi)膜組織，對照組與實驗組大鼠的異位內(nèi)膜組織，分別進(jìn)行高通量測序：提取樣本中的總RNA，在測定其完整性后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR 儀進(jìn)行擴增，經(jīng)HiseqTM儀進(jìn)行測序，ASprofile、Blast、String Tie、DESeq 等軟件統(tǒng)計分析差異表達(dá)的基因。采用Fold Change篩選差異表達(dá)的基因：當(dāng)|log2（Fold Change）|＞1，P＜0.05，q＜0.05時為差異表達(dá)的靶點基因。

1.2.7 PCR 驗證各組樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO mRNA 表達(dá) 取各組大鼠的異位內(nèi)膜組織以及假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織，提取樣本中的RNA，按要求測定完整性和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，PCR 儀進(jìn)行擴增。以GAPDH 為參照物，目的基因相對表達(dá)以2-ΔΔCt進(jìn)行表示。各基因序列見表1。

表1 各基因的引物序列Tab.1 Primer sequence of each gene

1.2.8 Western blot 驗證各組樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO 的表達(dá) 取各組大鼠的異位內(nèi)膜組織以及假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織，裂解，離心，常規(guī)提取總蛋白，上樣，電泳后，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗（1∶1 000），二抗（1∶5 000）稀釋后，室溫孵育，顯色30 min，以GAPDH 為參照，分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Graphpad 8.0進(jìn)行作圖，對于各組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量等符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩兩比較采用LSD 法，統(tǒng)計數(shù)據(jù)的差異分析通過SNK檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠動情周期的監(jiān)測 每日上午9：00，通過陰道涂片法監(jiān)測各組大鼠陰道分泌物的形態(tài)變化，觀察其動情周期的變化。大鼠處于動情前期時，視野中多為橢圓形上皮細(xì)胞，少量白細(xì)胞和焦化細(xì)胞；大鼠處于動情期時，視野中多為片狀上皮細(xì)胞，偶見白細(xì)胞；大鼠處于動情后期時，視野中出現(xiàn)白細(xì)胞、上皮細(xì)胞，片狀角化細(xì)胞，且各細(xì)胞數(shù)量無明顯差異；大鼠處于動情間期時，視野中多為白細(xì)胞，間或有少量黏液（圖1）；在實驗過程中，按動情前期-動情期-動情后期-動情間期的順序出現(xiàn)，順序一旦紊亂，或大鼠長時間持續(xù)處于某一期，視為動情周期紊亂（動情周期紊亂的比例等于處于動情周期紊亂的大鼠的數(shù)量與總數(shù)量的比值）。

圖1 正常動情周期中大鼠陰道分泌物觀察（×200）Fig.1 Observation of rat vaginal secretions during normal estrus cycle （×200）

2.2 各組大鼠造模情況、動情周期以及異位內(nèi)膜體積的比較 在實驗過程中，未發(fā)生大鼠死亡的現(xiàn)象；假手術(shù)組大鼠毛發(fā)光亮整齊，精神狀態(tài)良好，實驗過程中，活動量、飲食與進(jìn)水物未見明顯異常，體質(zhì)量增加明顯；模型組與對照組大鼠皮毛雜亂，暗淡，精神倦怠，腹脹明顯，雙目無神，活動量明顯減少，飲水與進(jìn)食意愿不強烈，體質(zhì)量增加不明顯；實驗組大鼠的臨床癥狀較模型組有較大改善，大鼠皮毛較為整齊，精神較好，活動量明顯增多。

對各組大鼠的動情周期的監(jiān)測結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，在實驗過程中，模型組、對照組、實驗組大鼠中動情周期紊亂比例明顯升高；與對照組相比，實驗組大鼠中動情周期紊亂的比例明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠動情周期紊亂情況比較Fig.2 Comparison of disorder of estrous cycle of rats in each group

各組大鼠異位內(nèi)膜體積檢測結(jié)果顯示：假手術(shù)組未進(jìn)行自體內(nèi)膜移植，模型組大鼠的腹壁處可見明顯的異位病灶，大多呈囊狀，內(nèi)含淡黃色囊液，囊泡表面可見豐富的微血管，病灶部位沿灶點蔓延生長，多為無色透明狀，且與周邊子宮、盆腔腹膜、卵巢或大網(wǎng)膜組織形成粘連，不易分離。與假手術(shù)組相比，模型組、對照組、實驗組大鼠中異位內(nèi)膜體積明顯增大；與對照組相比，實驗組大鼠中異位內(nèi)膜體積明顯減小，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠異位內(nèi)膜體積的比較Fig.3 Comparison of ectopic endometrium volume of rats in each group

2.3 各組大鼠異位內(nèi)膜組織病理學(xué)損傷 HE 染色顯示，假手術(shù)組大鼠子宮在位內(nèi)膜組織的上皮細(xì)胞排列整齊，成規(guī)整的柱狀，細(xì)胞連接緊密，微絨毛結(jié)構(gòu)清晰可辨，數(shù)量豐富，間質(zhì)以及腺體細(xì)胞未見異常；模型組和對照組大鼠的子宮異位內(nèi)膜組織上皮細(xì)胞明顯增生，排列松散，間質(zhì)增生明顯，炎癥介質(zhì)大量浸潤，新生微血管數(shù)量驟增，腺體丟失，胞質(zhì)內(nèi)可觀察到明顯的空泡樣變性，內(nèi)膜變薄。實驗組大鼠的子宮異位內(nèi)膜組織中間質(zhì)增生數(shù)量明顯減少，炎癥浸潤以及血管新生的狀況得到明顯緩解，見圖4。

圖4 HE染色（×400）Fig.4 HE staining （×400）

2.4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織超微結(jié)構(gòu)損傷 電鏡觀察結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織細(xì)胞的細(xì)胞器均規(guī)整地分布在胞漿中，微絨毛結(jié)構(gòu)未見異常；模型組和對照組大鼠的異位內(nèi)膜組織的上皮細(xì)胞具備微絨毛結(jié)構(gòu)，胞漿中的細(xì)胞器趨于穩(wěn)定；實驗組大鼠的異位內(nèi)膜組織的上皮萎縮明顯，微絨毛或減少或丟失，胞核固縮，線粒體明顯減少，嵴結(jié)構(gòu)趨于模糊，或見凋亡的間質(zhì)細(xì)胞，見圖5。

圖5 電鏡觀察結(jié)果（×8 000）Fig.5 Results of electron microscope observation （×8 000）

2.5 各組大鼠血清指標(biāo)的比較 ELISA 試劑盒檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、對照組、實驗組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量明顯升高；與對照組相比，實驗組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量Fig.6 Contents of TNF-α and IL-1β in serum of rats in each group

2.6 樣本組織中差異基因的高通量測序 高通量測序結(jié)果經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理，假手術(shù)組與模型組，對照組與實驗組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行比較，篩選出|log2（Fold Change）|＞1，P＜0.05，q＜0.05的差異表達(dá)基因，如圖7所示，假手術(shù)組和模型組之間獲得2 487 個差異表達(dá)基因，其中413 個為下調(diào)基因，2 074 個為上調(diào)基因；對照組和實驗組之間獲得2 258 個差異表達(dá)基因，其中307 個為下調(diào)基因，1 951 個為上調(diào)基因；為找到與干預(yù)措施相關(guān)的靶點基因，將模型組對比假手術(shù)組上調(diào)并且實驗組對比對照組下調(diào)的215個基因，以及模型組對比假手術(shù)組下調(diào)并且實驗組對比對照組上調(diào)的193個基因（圖8）進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組中HIF-1α、MPO 基因的表達(dá)明顯升高，RNA干擾VEGF的表達(dá)后，與對照組相比，實驗組中HIF-1α、MPO 基因的表達(dá)明顯下降，見表2，因此以HIF-1α、MPO 基因作為后續(xù)研究的靶點基因。

圖7 差異表達(dá)基因的火山圖Fig.7 Volcano map of differentially expressed genes

圖8 各組交集基因的韋恩圖Fig.8 Venn diagram of overlapping genes of each group

表2 Top 10基因（上調(diào)和下調(diào)表達(dá)）Tab.2 Top 10 genes （up-regulated and down-regulated）

2.7 各組樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO mRNA表達(dá) PCR 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織相比，模型組、對照組、實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF-1α、MPO mRNA 表達(dá)明顯升高；與對照組相比，實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF-1α、MPO mRNA 表達(dá)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖9。

圖9 樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO mRNA表達(dá)Fig.9 mRNA expressions of VEGF， HIF-1α and MPO in sample tissues

2.8 各組樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織相比，模型組、對照組、實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF-1α、MPO 蛋白表達(dá)明顯升高；與對照組相比，實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中VEGF、HIF-1α、MPO 蛋白表達(dá)明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；對照組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖10。

圖10 樣本組織中VEGF、HIF-1α、MPO的表達(dá)Fig.10 Expressions of VEGF，HIF-1α and MPO in sample tissues

3 討論

近來隨著人們生活方式的變化，宮腔鏡、人工流產(chǎn)術(shù)、剖宮產(chǎn)術(shù)等技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使具有生長性能的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在子宮腺體以外部位的概率升高，EMs的發(fā)病率隨之逐年升高，該病的臨床表現(xiàn)呈現(xiàn)多樣性，不具典型的復(fù)雜性，且極易反復(fù)發(fā)作，使其成為婦科領(lǐng)域的疑難病之一，給患者的健康生活帶來嚴(yán)重挑戰(zhàn)。該病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，影響因素較多，分子機制尚處在實驗研究階段，臨床上尚缺乏根治性的治療措施［7］。因此從分子機制入手，探討疾病的發(fā)生、發(fā)展，對于疾病的新藥開發(fā)以個體化靶向干預(yù)具有重大意義。

子宮內(nèi)膜異位定植于腹腔壁并進(jìn)行增殖、生長的過程需要充足的營養(yǎng)物質(zhì)保障，而營養(yǎng)物質(zhì)以及能量的代謝與交換依賴于微血管的生成，因此血管新生是EMs 病程中關(guān)鍵事件，VEGF 是體內(nèi)促血管新生的特異性最高的調(diào)控因子，VEGF 能較大幅度地增強血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附、運動等生物學(xué)行為，最終導(dǎo)致血管新生［8］。SONG 等［9］研究證明在乳腺癌細(xì)胞中抑制VEGF 的表達(dá)，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞血管新生的能力，下調(diào)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲的性能。WANG 等［10］臨床研究發(fā)現(xiàn)在先兆性子癇的患者血清中，VEGF 的表達(dá)明顯升高，細(xì)胞體外血管生成的能力隨之升高。ARABLOU 等［11］研究表明VEGF 在EMs 中表達(dá)升高，下調(diào)VEGF 的表達(dá)能明顯改善EMs的進(jìn)展，但未探討其中的作用機制。本研究構(gòu)建EMs 大鼠模型后，采用RNA 干擾VEGF 的表達(dá)后，實驗組大鼠的動情周期紊亂比例、異位內(nèi)膜體積等臨床癥狀明顯下調(diào)，異位內(nèi)膜組織的損傷以及超微結(jié)構(gòu)的損傷明顯加劇，證實這一干預(yù)技術(shù)對EMs的治療效果。

EMs 的起病、發(fā)展與患者腹腔內(nèi)的微環(huán)境密不可分。在正常狀態(tài)下，經(jīng)血逆流進(jìn)入患者腹腔時會被即時清除，但是子宮內(nèi)膜發(fā)生異位時，往往出現(xiàn)局部缺血、缺氧的狀況形成其獨特的微環(huán)境，并且異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞可激活腹腔內(nèi)的靶細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞等）分泌并釋放TNF-α和IL-1β等促炎因子，以致患者腹腔內(nèi)出現(xiàn)缺氧炎癥性微環(huán)境［12］。HIF-1α 是機體內(nèi)缺氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控因子，直接參與EMs 的深入浸潤以及定植；MPO 是細(xì)胞進(jìn)行炎癥應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，負(fù)責(zé)將EMs 的炎癥應(yīng)激級聯(lián)放大［13］。高通量測序技術(shù)因其靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢廣泛用于疾病靶點基因的篩選中［14］。本研究的高通量測序結(jié)果顯示HIF-1α、MPO 基因是進(jìn)行RNA 干擾VEGF 后的靶點基因，Western blot 驗證顯示與假手術(shù)組大鼠的在位內(nèi)膜組織相比，模型組、對照組、實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中HIF-1α、MPO 明顯升高，與對照組相比，實驗組大鼠異位內(nèi)膜組織中HIF-1α、MPO 明顯降低；ELISA 試劑盒檢測結(jié)果顯示RNA 干擾VEGF 后，患者血清中TNF-α和IL-1β含量明顯下降。

綜上所述，RNA 干擾VEGF 的表達(dá)后能明顯抑制HIF-1α、MPO 的表達(dá)，改善EMs 大鼠腹腔的缺氧和炎癥微環(huán)境，但是如何將這一發(fā)現(xiàn)用于臨床上EMs 的治療，仍需結(jié)合患者的個體狀況進(jìn)行更為深入、系統(tǒng)的研究。