腫瘤相關(guān)巨噬細胞在三陰性乳腺癌中的研究進展

隋 陽 趙治宇 吳長君 （哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱 150001）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）指雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長因子-2受體均為陰性的乳腺癌亞型，占浸潤性乳腺癌的12%～17%［1］。相較于其他乳腺癌亞型，TNBC 復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率最高［2］。目前TNBC 治療多以化療為主［3］。受限于嚴重全身毒副作用、靶向性較差和耐藥性，轉(zhuǎn)移患者化療療效甚微。針對TNBC 的特殊性，尋找一種獨特有效的治療策略迫在眉睫。

MATHOT 等［4］針對腫瘤細胞及其微環(huán)境關(guān)系的“種子-土壤”理論使腫瘤治療不再局限于腫瘤自身，而是轉(zhuǎn)向基于腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）干擾與重塑的腫瘤治療新策略。隨著TME 研究不斷深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)TME 中的免疫細胞在腫瘤進展中有著復(fù)雜且不可忽視的作用。眾多免疫細胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMs）是最主要的成分，可占實體腫瘤成分的50%以上［5］。TAMs 參與了TNBC 從發(fā)生到轉(zhuǎn)移的全過程，且在判斷TNBC 無病生存期及總生存期方面具有潛在價值［6-8］。鑒于此，本文僅就TAMs 在TNBC進展與治療中的作用進行綜述。

1 TAMs極化及其誘導(dǎo)

骨髓來源巨噬細胞循環(huán)前體在受到腫瘤細胞表達的炎癥遞質(zhì)及趨化因子（CCL12、CSF-1、VEGF等）作用下，被募集到TME 中參與腫瘤免疫應(yīng)答［9］。被募集的TAMs 在不同激活條件下可分化為表型及功能不同的巨噬細胞：在脂多糖（LPS）、IFN-γ 等刺激下，TAM 活化為經(jīng)典途徑激活巨噬細胞（M1 型）；在IL-10、TGF-β 等抗炎因子刺激下，TAM 活化為非經(jīng)典途徑激活巨噬細胞（M2型）［10］。M1型巨噬細胞是高效的促炎免疫效應(yīng)細胞，在損傷或炎癥激活后釋放超氧陰離子和氮自由基充分發(fā)揮其細胞外殺傷作用，并將抗原呈遞給T細胞觸發(fā)抗腫瘤效應(yīng)［11］。而M2 型巨噬細胞則具有修復(fù)損傷組織、抑制炎癥反應(yīng)的腫瘤免疫負向調(diào)節(jié)作用［12］。腫瘤環(huán)境中，IL-10 和TGF-β可實現(xiàn)M1型向M2型轉(zhuǎn)化［13］。

受腫瘤細胞外基質(zhì)相互作用影響，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)TAMs 傾向于向M2 型極化，TNBC 也不例外［14-16］。STEENBURGGE等［17］將巨噬細胞RAW264.7與TNBC 細胞4T1 共同接種于小鼠乳腺導(dǎo)管模擬TNBC 從原位癌進展至浸潤性癌過程，發(fā)現(xiàn)細胞接種到腫瘤細胞突破導(dǎo)管基底膜過程中，相較于單獨接種巨噬細胞組，共同接種組M1 型巨噬細胞相關(guān)細胞因子IL-12 表達明顯下降，M2 型巨噬細胞相關(guān)細胞因子TGF-β1 水平顯著升高，并伴有淋巴結(jié)及遠處肺轉(zhuǎn)移，研究中還觀察到小鼠外周血中MMP-8及VEGF 水平升高，MMP-8 及VEGF 是重要的M1/M2 極化的誘導(dǎo)因子，因此推測在腫瘤細胞誘導(dǎo)下，TAMs的M2型極化是一個交替的正反饋過程。

miRNA 是一類具有原癌和抑癌雙重作用的非編碼單鏈小分子［18］。研究表明，miRNA 通過參與TAMs 極化通路發(fā)揮原癌作用。MENG 等［19］將過表達miR-200c 的TNBC 細胞系MDA-MB-231 與巨噬細胞RAW264.7 共培養(yǎng)，M2 型TAMs 標(biāo)志物CD206 表達增加，IL-10 表達上調(diào)，表明miR-200c 參與了TAM向M2 型極化的過程。而WENG 等［20］發(fā)現(xiàn)，miR-34a可誘導(dǎo)TAM 向M1 型極化。分別采用病毒轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 細胞mi-34a 和mi-34a 干擾片段，并與單核細胞THP-1 共孵育后發(fā)現(xiàn)，miR-34a 表達的癌細胞比miR-34a 抑制表達的癌細胞更易誘導(dǎo)THP-1向M1型巨噬細胞極化。

2 TAMs在TNBC進展中的作用

2.1 促進腫瘤血管新生 腫瘤血管生成是TNBC增殖與轉(zhuǎn)移的必備環(huán)節(jié)，TAMs 在促進腫瘤血管生成方面扮演不可或缺的角色。乏氧是實體腫瘤重要特征之一，TNBC 中，乏氧可刺激缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）表達，進而激活HIF-CSF 通路，大量招募巨噬細胞至腫瘤區(qū)域，該過程是TME 中巨噬細胞募集的關(guān)鍵步驟［21］。募集的巨噬細胞可參與腫瘤血管生成各階段，如巨噬細胞產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶與蛋白水解酶可重構(gòu)細胞外基質(zhì)為新生血管生成提供有利條件，巨噬細胞分泌的細胞因子（如EGF、VEGF、TNF-α、TGF-β 等）可為新生血管提供網(wǎng)絡(luò)構(gòu)架等［22-23］。

2.2 促進淋巴管形成 TME 中的巨噬細胞可促進淋巴管內(nèi)皮細胞生長，為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移提供支持。受腫瘤細胞誘導(dǎo)，巨噬細胞過表達β4 整合素，在β4整合素趨化下，巨噬細胞聚集黏附于淋巴管近端，其自身表達的TNF-β1 驅(qū)動淋巴內(nèi)皮細胞收縮。此外聚集的巨噬細胞通過提高通透性、破壞周圍組織進行淋巴管重構(gòu)以實現(xiàn)腫瘤細胞經(jīng)淋巴途徑轉(zhuǎn)移［24-25］。血管、淋巴管系統(tǒng)新生及重構(gòu)是巨噬細胞組織修復(fù)功能的一部分，但在腫瘤環(huán)境中卻提高了腫瘤侵襲性。

2.3 腫瘤免疫抑制與免疫逃逸 巨噬細胞具有強大的吞噬能力和抗原呈遞能力，是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的重要角色。TME 中，TAMs 由具有腫瘤殺傷功能的M1 型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂薪M織修復(fù)功能的 M2 型，極大削弱了免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用。M1型至M2型轉(zhuǎn)化不僅限制了巨噬細胞固有的識別與吞噬能力，抑制了與其協(xié)同的CD4+T細胞及CD8+T 細胞腫瘤殺傷能力，還可激活Treg與輔助性T細胞，導(dǎo)致腫瘤免疫抑制［26］。

隨著TAMs 中免疫檢查點受體-程序性死亡 蛋白-1（programmed cell death protein 1，PD-1）及其配體PD-L1 研究深入，巨噬細胞在腫瘤免疫抑制及逃避中的作用也有了新的發(fā)現(xiàn)。PD-1 作為限制 T 細胞殺傷作用的調(diào)控因子，廣泛存在于多種T 細胞。PD-L1 是PD-1 的受體，多表達于腫瘤細胞與巨噬細胞表面［27］。TNBC 細胞被證實高表達PD-L1，其腫瘤環(huán)境中的T 細胞殺傷作用受到明顯抑制［28］。TNBC 腫瘤細胞激活后TAMs 的JAK-2/STAT3 通路被激活，PD-L1 表達升高，進一步抑制CD8+T 細胞的腫瘤殺傷作用［29］。另有研究表明，PD-1也可表達于TAMs 表面，且?guī)缀醣磉_于所有M2 型TAMs，高表達PD-1 的TAMs 吞噬能力減弱，一定程度上降低了抗腫瘤免疫作用，而阻斷PD-1/PD-L1 可增強巨噬細胞吞噬能力，抑制腫瘤生長，有效延長荷瘤鼠生存期［30］。腫瘤細胞誘導(dǎo)下，TAMs 成為腫瘤免疫抑制與免疫逃逸的重要遞質(zhì)和調(diào)控因素。

2.4 促進TNBC 遷移和侵襲 TME 中，TAMs 高密度浸潤提示較高的腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險［31］。JOYCE 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，TAMs 分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶、半胱氨酸組織蛋白酶和絲氨酸蛋白酶可水解細胞外基質(zhì)，有利于腫瘤細胞向周圍侵襲。另一方面TAMs 可通過參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化增強腫瘤細胞干性，提高腫瘤細胞侵襲性。YANG 等［33］將不同表型巨噬細胞與MDA-MB-231細胞共孵育5 d后發(fā)現(xiàn)，與M1 型巨噬細胞共孵育細胞光鏡下表現(xiàn)為鵝卵石樣的上皮樣細胞，而與M2 型巨噬細胞共孵育細胞則表現(xiàn)為更細長的間充質(zhì)樣細胞。此外，相較于與M2型巨噬細胞共孵育的腫瘤細胞，與M1 型共孵育的細胞E-鈣黏蛋白表達顯著升高，表明M1型TAMs 具有逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的潛力，可在一定程度上降低腫瘤細胞侵襲性。

3 TAMs的臨床意義

研究認為，TNBC 高密度的TAMs 浸潤與不良預(yù)后相關(guān)，且預(yù)示較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險［34］。通過對172 例患者的腫瘤組織行TAMs 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，較高病理分級患者常伴有較高TAMs 浸潤［35-36］。相較于低TAMs浸潤患者，高TAMs浸潤者總生存期和無病生存期顯著縮短。

此外，浸潤的TAMs 對化療療效也存在一定影響，阿霉素、鉑類化合物、紫杉醇等常見TNBC 化療藥物均可激活TAMs，激活的TAMs 可促進受損腫瘤組織修復(fù)，進而誘導(dǎo)化療耐受［37］。不僅如此，TAMs可產(chǎn)生大量IL-10，后者可抑制樹突狀細胞產(chǎn)生IL-12， 限制了以CD8+T 細胞為主的腫瘤免疫殺傷作用［38］。LITVIAKOV 等［39］選擇CD68 作為TAMs 標(biāo)志物以評估腫瘤中M1 型TAMs 和M2 型TAMs 數(shù)量，CCL18 和YKL-39 作為M2 型TAMs 特異標(biāo)志物研究患者對蒽環(huán)類化療藥的反應(yīng)性與CCL18、YKL-39 表達的關(guān)系，對68 例患者進行4～6 個療程的蒽環(huán)類藥物新輔助化療發(fā)現(xiàn)，CCL8 及YKL-39 高表達者對新輔助化療反應(yīng)較差，而CD68 表達在反應(yīng)良好組與反應(yīng)不良組間無明顯差異，可見相較于TAMs 數(shù)量，TAMs表型更適于成為化療療效指標(biāo)。

4 TAMs靶向治療

4.1 傳統(tǒng)TAMs 靶向策略 近年TAMs 靶向治療思路主要以抑制TAMs募集、TAMs耗竭、逆轉(zhuǎn)TAMs極化為主。阻斷趨化因子作用是抑制TAMs 募集的重要方法，目前研究靶標(biāo)多為CCL2/CCR2［40-41］。CCL2/CCR2 軸激活可減少骨髓單核細胞動員，進而降低巨噬細胞在乳腺中的浸潤。已有研究表明，曲貝替定、硼替佐米可通過降低血漿中CCL2 含量抑制巨噬細胞募集［42］。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，CCL5可通過在殘留腫瘤中招募巨噬細胞誘使乳腺癌復(fù)發(fā)，CCL5或可成為TNBC輔助化療及遏制復(fù)發(fā)的重要靶點［43］。

以二磷酸鹽為主的巨噬細胞凋亡誘導(dǎo)劑（如氯膦酸、唑來膦酸等）已被廣泛用于TAMs 耗竭。二磷酸鹽極易通過內(nèi)吞作用被巨噬細胞捕獲，內(nèi)化的二磷酸鹽可抑制FPP 合成酶活性，通過限制RAS 相關(guān)蛋白異戊烯化誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡［44］。小鼠自發(fā)性乳腺癌模型中連續(xù)給予唑來膦酸治療，可顯著減少新生血管生成，降低TAMs密度，提高生存率［45］。

細胞因子可有效調(diào)控TAMs 極化方向。當(dāng)TAMs 暴露于CD4+Th1 細胞分泌的細胞因子（如TNF、IL-12等）時，TAMs傾向于M1型極化［42］。NF-κB 通路是調(diào)節(jié)CD4+Th1 細胞因子轉(zhuǎn)錄的重要通路， LI 等［46］發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草提取物可通過激活NF-κB 通路促進TAMs向M1型極化，進而抑制TNBC進展。

4.2 TAMs 相關(guān)靶向納米工程 腫瘤靶向納米粒子是非常有前景的藥物遞送系統(tǒng)，具有高特異性、高滲透性和高相容性，不僅可增加腫瘤內(nèi)部藥物累積，增強藥物抗腫瘤作用，還可減少藥物對非靶向器官的細胞毒性作用，降低藥物副作用。常用納米粒子殼層材料以脂質(zhì)體和聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］為主，而巨噬細胞來源分泌囊泡有良好組織相容性及靶向性，粒徑小，相較于傳統(tǒng)納米粒子材料更能避免胞內(nèi)溶酶體逃逸，增加胞質(zhì)內(nèi)藥物累積，因此是非常有前景的納米藥物載體殼層。HANEY 等［47］利用超速離心法分離純化巨噬細胞條件培養(yǎng)基中收獲的胞外囊泡，并在不同條件下分別裝載紫杉醇和阿霉素，構(gòu)建了以巨噬細胞來源囊泡為遞送系統(tǒng)的靶向納米藥物，體內(nèi)和體外實驗均顯示出了良好的抗腫瘤作用。LI等［48］將去除包涵物質(zhì)的巨噬細胞來源外泌體與裝載阿霉素的PLGA 納米顆?；旌?，并通過孔徑 100 nm 的聚碳酸酯多孔膜構(gòu)建了粒徑大小一致的復(fù)合納米靶向粒子，不僅提高了靶向腫瘤細胞核的能力，促進藥物核內(nèi)累積，延長了藥物體內(nèi)半衰期，體內(nèi)外腫瘤抑制作用也十分顯著。TNBC 術(shù)后復(fù)發(fā)率高，相較于傳統(tǒng)納米粒子，巨噬細胞可受術(shù)后炎癥因子及殘留腫瘤干細胞雙重趨化，克服了傳統(tǒng)納米粒子在術(shù)后腫瘤血運破壞后藥物內(nèi)滲及滯留效率降低障礙?；赥AM 的這項優(yōu)勢，QIU 等［49］將包裹紫杉醇和白藜蘆醇的脂質(zhì)體表面以八精氨酸（R8）修飾，并以巨噬細胞作為載體建立了一種“雙引導(dǎo)”靶向給藥系統(tǒng)，膜融合和炎癥觸發(fā)將藥物輸送到復(fù)發(fā)腫瘤細胞。TNBC 術(shù)后復(fù)發(fā)小鼠模型中，該納米粒子表現(xiàn)出較好抑制作用，并下調(diào)腫瘤相關(guān)和炎癥相關(guān)細胞因子水平。GONG 等［50］將巨噬細胞膜與4T1 細胞膜進行融合雜化，利用雜化膜包被DOX 的PLGA 納米粒子，納米粒子與巨噬細胞和癌細胞形成雜交膜偶聯(lián)后，在炎癥部位高度聚集并特異性靶向轉(zhuǎn)移灶，抗轉(zhuǎn)移率高達88.9%。雜化膜的多靶向能力為乳腺癌轉(zhuǎn)移提供了有前景的治療策略。將納米粒子靶向給藥系統(tǒng)用于傳統(tǒng)TAMs 靶向策略也是目前研究熱點。納米粒子能夠搭載藥物、金屬材料、小干擾RNA，并進一步組合，通過多種作用機制協(xié)同發(fā)揮作用干預(yù)TAMs。ZANGANEH 等［51］證明了FDA 批準(zhǔn)的右旋糖酐包覆氧化鐵納米顆?？赏ㄟ^鐵氧化物介導(dǎo)的Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生ROS，介導(dǎo)TAMs 向M1 型巨噬細胞復(fù)極化，從而抑制乳腺癌進展和肺、肝轉(zhuǎn)移。SUN 等［52］通過將包裹MnO 殼載DOX 孔碳納米球內(nèi)化到巨噬細胞，開發(fā)了一種增強化療/化學(xué)動力協(xié)同治療的巨噬細胞載體（MMDM）。由此產(chǎn)生的MMDM 可避免過早泄漏藥物導(dǎo)致細胞功能障礙，并最大限度維持細胞活力。在腫瘤組織中積聚后，MMDM 可在近紅外激光下被摧毀，使納米顆粒從載體巨噬細胞中充分釋放。釋放的納米顆粒可分解HO，在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生O緩解腫瘤缺氧。同時，納米顆粒MnO 殼層被細胞內(nèi)谷胱甘肽還原為Mn，釋放DOX，從而增強了Mn介導(dǎo)的類Fenton反應(yīng)。TAMs 相關(guān)靶向納米粒子研究具有廣闊空間和前景。

5 小結(jié)與展望

TAMs 是腫瘤微環(huán)境重要組分，在浸潤免疫細胞中占有很高比例。TAMs 通過調(diào)控腫瘤細胞免疫逃避、腫瘤血管及淋巴管生成等參與TNBC 發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移全過程。TAMs 在TME 中轉(zhuǎn)換表型促使TME 由抗腫瘤狀態(tài)轉(zhuǎn)為免疫抑制狀態(tài)，這一動態(tài)變化使得TAMs 成為調(diào)控腫瘤行為與療效評價反饋的重要環(huán)節(jié)。鑒于TAMs 在腫瘤進展中的重要作用，基于TAMs 的治療策略應(yīng)運而生。受TNBC 高異質(zhì)性影響，僅針對單一TAMs 相關(guān)通路的靶向治療無法達到良好療效，未來基于TAMs 的多模式靶向治療將成為研究熱點。