PLZF調(diào)控小鼠早期T細胞發(fā)育和自我更新的功能①

李鳳迪 袁肇方 劉新宇 黃海巖 杜江龍 蔡葵蒸 （西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030）

早幼粒細胞白血病鋅指基因也被稱為Zbtb16基因，其調(diào)控的蛋白稱為PLZF（the protein encoded by pro-myelocytic leukemia zinc finger，PLZF）。Zbtb16首次發(fā)現(xiàn)是在一位急性早幼粒細胞白血病患者中，這是一個以前未報道過的鋅指基因，與其t（11；17）染色體易位有關(guān)，目前研究最多的是其炎癥反應抑制因子的功能［1-2］。近年來，PLZF 已成為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子并在細胞生長中起關(guān)鍵作用，既能抑制反應性T 細胞的增殖和成熟也能誘導其凋亡［3-4］。PLZF 能在先天淋巴樣細胞（innate lymphoid cells，ILCs）、CD8+T 細胞以及CD4+T 細胞中表達，尤其是在iNKT 細胞（invariant natural killer T cell，iNKT）中高表達，是一種標志性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對iNKT 細胞分化、發(fā)育和功能的調(diào)控是必不可少的［5-7］。PLZF作為一種多功能的蛋白質(zhì)，可調(diào)節(jié)多種生物過程：如精子發(fā)生、細胞增殖、分化、器官發(fā)育、干細胞維持和先天性免疫細胞發(fā)育以及腫瘤形成等［8］。目前，許多研究表明PLZF 參與癌癥的發(fā)展，能夠抑制許多癌細胞生長，包括黑色素瘤、惡性間皮瘤、前列腺癌和非小細胞肺癌等［5，9-11］。PLZF 之所以作為一個標志外周T 細胞淋巴瘤（PTCL）亞群（成熟T 細胞淋巴瘤的異質(zhì)性疾病類型）的蛋白質(zhì)，是因為其存在人類淋巴細胞中多于在小鼠中［12-13］。早期T 細胞系前體在胸腺中發(fā)育為T淋巴細胞是一個高度調(diào)控的過程，調(diào)節(jié)涉及外部信號和細胞內(nèi)在機制［14］。最近研究發(fā)現(xiàn)PLZF 能調(diào)節(jié)造血干細胞功能，參與細胞周期調(diào)控，并在控制造血干細胞穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用［15］。本文通過PLZF-EGFP 報告基因小鼠和新生小鼠胸腺的腎移植模型，利用流式細胞術(shù)和細胞分選以及RT-PCR 技術(shù)，初步研究PLZF 在小鼠早期T細胞發(fā)育和自我更新過程中的功能，對PLZF 是否參與胸腺內(nèi)T 細胞的早期發(fā)育及維持早期T 細胞系前體的自我更新進行系統(tǒng)性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 動物實驗由西北民族大學實驗動物倫理委員會審批。PLZF-/-、PLZF-EGFP 報告基因小鼠（簡稱為PEG 小鼠），其EGFP 的表達受PLZF啟動子活性的調(diào)控，Rag2-/-和Rag2/γc-/-小鼠購自上海南方模式生物科技有限公司。所有小鼠均為C57BL/6 背景，在4～8 周齡時用于實驗。實驗中PLZF-/-小鼠的對照為條件許可時采用同窩出生的野生型小鼠，或年齡和性別一致的C57BL/6小鼠。

1.1.2 主要試劑及儀器 RNA 提取試劑（QIAGEN公司）；實時熒光定量PCR 試劑（Bio-Rad 公司）；胎牛血清（Gibco 公司）；BSA（Amresco 公司）；DMEM、胰蛋白酶（蘭州民海生物公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific 公司）；阿維汀、甲醇、冰醋酸、無水乙醇、NaHCO3、異丙酮（上海生工公司）； 細胞培養(yǎng)皿（corning 公司）；流式細胞術(shù)用到的抗 體如下：CD45.1（A20）、CD45.2（104）、Sca-1（E13-161.7）、c-Kit（2B8）、Flt3（A2F10）、IL-7Ra（A7R34）、CD93（AA4.1）、B220（RA3-6B2）、CD19（6D5）、CD11b（M1/70）、Gr-1（RB6-8C5）、CD44（IM7）、CD25（PC61）、Thy1.2（30-H12）、CD4（RM4-5）、CD8α（53-6.7）、TCR-β（H57），均購自Biolegend 公司；流式細胞儀（LSR Ⅱ and FACSAria cell sorter，BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 新生小鼠胸腺移植模型的建立 將新生小鼠（CD45.2）的胸腺取下，移植于同系受體小鼠（CD45.1）的腎被膜下，用阿維汀（2.5%溶液，10 U/g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉。在腹腔做一個5 mm的切口，體式顯微鏡下暴露左腎，用顯微解剖鉗將單個新生鼠的兩個胸腺葉置于腎被膜下，隨后縫合傷口。

1.2.2 流式細胞術(shù)和細胞分選 胸腺移植的小鼠飼養(yǎng)3 周后，解剖小鼠并制備胸腺和骨髓單細胞懸液，使細胞懸浮于含0.1%BSA和0.08%疊氮化鈉的PBS 緩沖液中（染色緩沖液）。于4 ℃下將抗體在染色緩沖液中孵育20 min。封閉Fc 受體：使用流式Staining Buffer 洗滌板孔2 次，200 μl/孔，在4 ℃、 1 500 r/min 下離心5 min；然后加入Staining Buffer 稀釋受體阻斷劑，1 μg/100 μl 中細胞106個，4 ℃放置 15 min 封閉阻斷受體。在Fc 受體封閉期間，配制表面染色抗體混合體系，封閉完成后使用Staining Buffer 洗滌板孔2 次，200 μl/孔，4 ℃、1 500 r/min 離心5 min，棄液體，振蕩重懸，加入表面染色抗體混合物 50 μl/孔，輕敲混勻，4 ℃條件下避光孵育30 min。將帶有生物素標記的抗體CD3ε、B220、TER-119、CD11bGr-1 混合在一起制成抗體混合物，命名為Lineage。將新鮮分離的胸腺細胞與Lineage 共同孵育來分選造血干細胞LSK。為了保留陰性細胞，用磁珠分離（MACS）將Lineage 陽性（Lin+）細胞去除。細胞富集后，用表面標志物對Lineage陰性細胞進行染色。然后上機分析，并采用FloJo進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 RNA 提取和實時定量PCR RNA 提取采用RNA 試劑盒操作，反轉(zhuǎn)錄采用iScriptTMcDNA Synthesis Kit 試劑盒操作。其中反轉(zhuǎn)錄反應條件設定：25 ℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄46 ℃ 20 min，RT失活95℃ 1 min，4 ℃保存。待檢基因的蛋白表達水平用HPRT （hypoxanthine phosphoribosyltransferase）mRNA 比對進行計算［16］。RT-PCR 所使用的引物如下：HPRT 正向引物5'-CTGCGGAAAACGGTTCCTG-3'，反向引物5'-GTGCCAGTATGGGTCTGTCT-3'。

1.3 統(tǒng)計學處理 本研究中的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5（San Diego，CA，USA）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PLZF-/-小鼠的胸腺細胞總數(shù)與野生型小鼠相比減少 分別取12 只PLZF+/+和12 只PLZF-/-小鼠的胸腺，對其胸腺細胞總數(shù)進行計數(shù)。結(jié)果顯示，PLZF-/-小鼠的胸腺細胞總數(shù)明顯少于野生型小鼠的胸腺細胞總數(shù)（圖1）。由GraphPad Prism 5.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析，其P=0.002＜0.01，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 PLZF+/+和PLZF-/-小鼠的胸腺細胞總數(shù)比較Fig.1 Comparison of total number of thymocytes in PLZF+/+ and PLZF-/- mice

2.2 小鼠骨髓造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）和胸腺DN2a 細胞中PLZF 呈高表達 為進一步研究PLZF 在T細胞發(fā)育過程中的表達情況，利用PEG 轉(zhuǎn)基因小鼠模型。分別獲取C57BL/6和PEG 小鼠的骨髓細胞，利用流式細胞儀對LSK 細胞（Lin-Sca-1+c-Kit+）進行開窗分析，根據(jù)其Flt3 的表達情況，將LSK 細胞分為HSC（LSK Flt3lo）和淋巴預處理多能祖細胞（lymphoid-primed multipotent progenitor，LMPP）（LSK Flt3hi）兩群。發(fā)現(xiàn)PEG 小鼠的HSC細胞的GFP 表達水平較高，而LMPP 細胞的GFP 水平與C57BL/6 小鼠表達無明顯差異（圖2A）。說明PLZF 在骨髓的HSC 中表達，而隨后在LMPP 中表達沉默。緊接著又分別獲取C57BL/6和PEG小鼠的胸腺細胞，利用流式細胞術(shù)對Lin-CD44+c-Kit+細胞進行開窗分析，根據(jù)其CD25 的表達情況，將Lin-CD44+c-Kit+細胞分早期T 細胞系前體（early T cell pro-genitors，ETP）（Lin-CD44+c-Kit+CD25-）和（CD4 CD8 double negative，DN）DN2a（Lin-CD44+c-Kit+CD25+）兩群。發(fā)現(xiàn)PEG 小鼠ETP 細胞的GFP 水平與C57BL/6小鼠相當，而PEG 小鼠DN2a 細胞的GFP 水平顯著升高（圖2B）。綜合PEG 小鼠骨髓和胸腺細胞的實驗結(jié)果，表明PLZF 在HSC 中表達，當其分化為LMPP 時表達下降乃至沉默，一直到遷移至胸腺發(fā)育為DN2a細胞時又重新表達（圖2C）。通過流式細胞術(shù)分選LSK、ETP、DN2（CD4-CD8-CD44+CD25+）和DN3（CD4-CD8-CD44-CD25+）細胞，利用RT-PCR 檢測PLZF 的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)PLZF 在造血干細胞LSK和DN2細胞中有較高的轉(zhuǎn)錄水平。但當T細胞發(fā)育至DN3時期時，PLZF的轉(zhuǎn)錄又降至極低水平。上述結(jié)果表明，PLZF 在T 細胞發(fā)育過程中是一個動態(tài)調(diào)控的過程（圖2D）。

圖2 T細胞發(fā)育過程中PLZF的表達情況Fig.2 Expression of PLZF during development of T cells

2.3 PLZF-/-小鼠的ETP數(shù)目減少 為檢測PLZF對T 細胞早期發(fā)育的影響，分別獲取C57BL/6 和PLZF-/-小鼠的胸腺細胞，利用流式細胞術(shù)對CD4-CD8-TCRβ-CD44+c-Kit+細胞進行開窗分析。結(jié)果顯示，PLZF-/-似乎對胸腺細胞中ETP和DN2a細胞的比例影響不大（圖3A）。但ETP 細胞的絕對數(shù)目在PLZF-/-小鼠中較C57BL/6 小鼠顯著減少，僅有50%左右（圖3B）。

圖3 PLZF-/-對小鼠ETP細胞的影響Fig.3 Effect of PLZF-/- on ETP cells in mice

2.4 PLZF-/-小鼠的胸腺細胞減少并非細胞內(nèi)在性的 為進一步判斷PLZF-/-小鼠的胸腺細胞總數(shù)減少是否是造血干細胞內(nèi)在性導致的，采用競爭性骨髓嵌合小鼠模型。分別將PLZF+/+（Ly5.1）和PLZF-/-小鼠經(jīng)免疫磁珠分選后富集的Sca-1+骨髓細胞按1∶1等量混合作為供體細胞，經(jīng)尾靜脈注射給預先經(jīng)亞致死劑量輻射過的受體小鼠（Rag2/γc-/-），飼養(yǎng)8 周后取胸腺進行流式細胞術(shù)分析。Rag2 和γc 雙基因缺陷使得受體小鼠自身的T、B 和NK 細胞均無法正常發(fā)育，只能完全來源于外源的供體細胞。結(jié)果表明，經(jīng)骨髓移植的受體小鼠胸腺細胞中，PLZF+/+和PLZF-/-來源的細胞比例大致相等，且均能在胸腺中進行正常的T 細胞發(fā)育（圖4A）。此外，在移植后的8周、24周取受體小鼠的脾臟進行分析，發(fā)現(xiàn)脾臟中B 細胞和T 細胞的PLZF+/+（Ly5.1）來源的細胞比例基本保持恒定，維持在50%左右，PLZF-/-細胞在競爭中保持水平（圖4B）。以上結(jié)果證明PLZF-/-小鼠的胸腺細胞減少不是細胞內(nèi)在性的原因。

圖4 PLZF-/-小鼠胸腺細胞減少的原因Fig.4 Causes of thymocytopenia in PLZF-/- mice

2.5 PLZF 在新生小鼠胸腺移植模型的移植物DN1細胞中高表達 為進一步研究PLZF 在T 細胞發(fā)育過程中的DN1 表達情況，將新生C57BL/6 或PEG 小鼠的胸腺取下，移植于受體小鼠Rag2/γc-/-的腎被膜下，4周后取胸腺移植物進行流式細胞術(shù)分析（圖5A）。對CD4-CD8-TCRβ-（簡稱為TN）的胸腺細胞進行開窗分析，將DN1 細胞（CD44+CD25-TN）按γc 的表達水平分為供體細胞（γc+）和受體細胞（γc-）。對來源于PEG 小鼠的供體細胞進行GFP 熒光強度分析發(fā)現(xiàn)，PLZF 在胸腺移植物的DN1 細胞中高表達，甚至高于陽性對照iNKT細胞（圖5B）。

圖5 新生小鼠胸腺移植模型的移植物DN1 細胞中PLZF高表達Fig.5 PLZF is high expression in DN1 cells of thymus transplantation model in neonatal mice

2.6 PLZF-/-可能影響新生小鼠胸腺移植模型的供體DN1 細胞自我更新 將新生PLZF+/+或PLZF-/-小鼠的胸腺取下，移植于受體小鼠Rag2/γc-/-的腎被膜下，4周后取胸腺移植物進行流式細胞術(shù)分析（圖6A）。對TN 胸腺細胞進行開窗分析，將DN1 細胞（CD44+CD25-TN）按γc 的表達水平分為供體細胞（γc+）和受體細胞（γc-）。結(jié)果顯示，在胸腺移植物中DN1 細胞來源于供體，與PLZF-/-小鼠胸腺作為供體的比例遠低于PLZF+/+小鼠胸腺作為供體（圖6B）。隨后將PLZF-/-小鼠胸腺作為供體與PLZF+/+小鼠胸腺進行比較，胸腺移植物中DN1 細胞來源于供體的絕對數(shù)量減少，而來源于受體小鼠的絕對數(shù)量增多（圖6C）。PLZF-/-并不影響胸腺移植物中供體T 細胞的正常發(fā)育，且胸腺移植物的絕對細胞數(shù)量與野生型差異無統(tǒng)計學意義（圖6D）。上述結(jié)果表明，PLZF-/-可能對T 細胞的正常發(fā)育和分化沒有影響，但很可能參與維持早期T細胞系前體的自我更新。

圖6 PLZF-/-可能影響新生小鼠胸腺移植模型的供體DN1細胞自我更新Fig.6 PLZF-/- may affect donor DN1 cell self-renewal in neonatal thymus transplantation model

3 討論

本研究通過競爭性骨髓嵌合小鼠模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)骨髓移植的受體小鼠胸腺細胞中，PLZF野生型和突變型來源的細胞比例大致相等，且均能在胸腺中進行正常的T 細胞發(fā)育，表明PLZF 對T 細胞分化發(fā)育的影響不是造血干細胞內(nèi)在性的。但在新生小鼠胸腺移植模型中，Rag2/γc-/-作為受體小鼠，PLZF-/-會導致胸腺移植物中DN1 細胞來自供體的比例顯著減少。當受體來源的早期T細胞系前體能夠分化至超越DN2 階段，供體胸腺細胞最終從胸腺移植物中消失。但當沒有持續(xù)的早期T 細胞系前體供應（如受體小鼠同時缺乏SCF 和IL-7 信號），或早期T 細胞系前體發(fā)育阻滯于DN3 階段之前（如受體小鼠 IL-7信號缺陷），供體胸腺細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵谛叵僖浦参镏谐掷m(xù)自主產(chǎn)生T細胞的模式。由于此受體小鼠缺乏IL-7 信號，“DN3 生態(tài)位”缺乏宿主來源的祖細胞的空間競爭，故供體胸腺細胞具備了自我更新的特征，而PLZF參與供體胸腺細胞的自我更新。

由于胸腺細胞自身壽命短，且缺乏具有自我更新能力的ETP 或長期駐留的胸腺細胞，所以胸腺的功能完全依賴于從骨髓來源的早期T 細胞系前體［17］。PEAUDECERF 等［18］研究發(fā)現(xiàn)胸腺細胞能被骨髓遷移而來的早期T 細胞系前體迅速取代，即使骨髓前體細胞不能產(chǎn)生T 細胞，但也會發(fā)生這種取代，如Rag1/2-/-或嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的小鼠。相反的是，MARTINS 等［19］研究了將新生小鼠胸腺移植于缺失IL-7 的小鼠中，發(fā)現(xiàn)新生小鼠胸腺具有自我更新的細胞群，且獨立于骨髓的任何能維持胸腺細胞群體，并能迅速重建外周T 細胞群，以及清除T細胞缺陷小鼠的受感染能力。因此，這就能解釋既往的試驗中雖能觀察到供體胸腺細胞消失但不能歸結(jié)為胸腺細胞壽命短的原因，當新出現(xiàn)的受體來源DN3 胸腺細胞和已產(chǎn)生的供體來源的胸腺細胞間存在競爭時，供體來源的胸腺細胞消失［20］。

本研究有助于全面揭示PLZF 調(diào)控早期T 細胞發(fā)育和自我更新的功能，為PLZF 在T細胞分化發(fā)育的功能提供了科學依據(jù)。