小鼠巨噬細(xì)胞極化與焦亡的關(guān)系研究①

張敏敏 寧 宗 （廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，南寧 530021）

巨噬細(xì)胞作為固有免疫的重要組成細(xì)胞，在器官發(fā)育、急慢性炎癥、機(jī)體抵抗病原體、組織修復(fù)和穩(wěn)態(tài)及免疫調(diào)節(jié)等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞具有顯著可塑性，可根據(jù)體內(nèi)外微環(huán)境變化而改變其生理功能，產(chǎn)生具有不同功能的細(xì)胞群體，這個(gè)過(guò)程稱為極化。根據(jù)表型和分泌細(xì)胞因子差異可將巨噬細(xì)胞分為經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞（M1 型，促炎表型）和替代活化的巨噬細(xì)胞（M2 型，抗炎表型）［1-2］。M1 型巨噬細(xì)胞由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和/或IFN-γ 誘導(dǎo)，分泌促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12 等，抗原提呈能力和殺菌能力增強(qiáng)，在炎癥早期能夠清除病原體，但也可能損傷宿主正常組織；M2 型巨噬細(xì)胞由IL-4 和/或IL-13誘導(dǎo)，分泌抗炎因子，如IL-4、TGF-β、IL-10、IL-13 等，在炎癥晚期能抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合，在過(guò)敏反應(yīng)、抵御寄生蟲(chóng)和真菌感染中發(fā)揮重要作用［2-5］。

近年越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥、LPS 可誘發(fā)巨噬細(xì)胞另一種程序性死亡——焦亡［6-10］。焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的伴有細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生和釋放的程序性細(xì)胞死亡。2001年COOKSON 等［11］首次將這種依賴于炎癥體的細(xì)胞死亡稱為“pyroptosis”，源于希臘語(yǔ)中與火或熱有關(guān)的詞根“pyro-”，細(xì)胞焦亡的 概念被首次定義。已知介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的途徑有 兩個(gè)：依賴caspase-1 的經(jīng)典途徑和依賴caspase-11 （小鼠）/-4/-5（人）的非經(jīng)典途徑［12-14］。與其他細(xì)胞死亡方式不同，細(xì)胞焦亡具有兩個(gè)最為明顯的特征：①活化的caspase-1/11 能夠切割GSDMD 蛋白，使其產(chǎn)生具有活性的N 端片段GSDMD-NT，并聚集于質(zhì)膜形成孔洞，使質(zhì)膜完整性破壞，細(xì)胞腫脹并發(fā)生滲透性溶解，最后發(fā)生焦亡［15-18］；②活化的caspase-1能促進(jìn)炎癥因子IL-1β 和1L-18 前體成熟，使大量IL-1β 和IL-18 通過(guò)質(zhì)膜孔釋放，最終導(dǎo)致局部或全身炎癥反應(yīng)［12，19-20］。

巨噬細(xì)胞極化后，M1/M2 比例失衡引起促炎和抑炎因子比例失控，導(dǎo)致局部或全身炎癥性疾病。而細(xì)胞焦亡釋放大量炎癥因子，也可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大，甚至出現(xiàn)炎癥風(fēng)暴，焦亡和巨噬細(xì)胞極化在這方面作用十分相似。研究表明LPS能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡，但發(fā)生M0、M1還是M2型尚不清楚，又或者均能發(fā)生，但三者發(fā)生的焦亡是否存在差異仍是未知的。但巨噬細(xì)胞極化為M1 型后引發(fā)的炎癥反應(yīng)與焦亡更為相似，于是提出假設(shè)，巨噬細(xì)胞焦亡可能以M1 型為主，如果用抑制劑精確靶向M1 型，阻斷caspase-1/11 介導(dǎo)的M1 型焦亡，或許能減少促炎因子釋放、減輕局部或全身炎癥反應(yīng)，從而緩解甚至治療相關(guān)疾病。目前巨噬細(xì)胞極化相關(guān)研究較多，巨噬細(xì)胞焦亡相關(guān)研究也越來(lái)越多，但尚未有巨噬細(xì)胞極化和焦亡關(guān)系的研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)極化實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)焦亡相關(guān)指標(biāo)觀察誘導(dǎo)極化后的巨噬細(xì)胞是否出現(xiàn)焦亡，并探討巨噬細(xì)胞極化類型與焦亡的關(guān)系，闡明巨噬細(xì)胞極化與焦亡的關(guān)鍵聯(lián)系，從而發(fā)現(xiàn)治療炎癥相關(guān)疾病的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞及完全培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽有限公司；LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Recombinant Mouse IFN-γ、IL-4、IL-13購(gòu)自Pepro-Tech 公司；FITC Anti-Mouse CD80 及PE Anti-Mouse CD86 購(gòu) 自BD Pharmingen 公 司；APC Anti-mouse CD206 購(gòu) 自 美 國(guó)Invitrogen 公 司；Flow Cytometry Staining Buffer 購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司；Anti-caspase-1 antibody、Anti-caspase-11 antibody、Anti-GSDMD antibody 均購(gòu)自Abcam 公司；Rabbit Anti-Cyclophilin B antibody 購(gòu)自Bioss 公司；熒光二抗Anti-rabbit IgG （H+L）購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；Trizol購(gòu)自 索萊寶公司；caspase-1、caspase-11、GSDMD、GAPDH 引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；Thermo Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas 公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）購(gòu)自碧云天公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；IL-1β、IL-18、TGF-β 小鼠ELISA 試劑盒購(gòu)自 上海江萊生物公司；LDH 試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司。

1.2 方法

1.2.1 LPS 和細(xì)胞因子誘導(dǎo)M0型巨噬細(xì)胞定向分化為M1/M2 型 收集培養(yǎng)瓶里的M0 型巨噬細(xì)胞，離心棄上清，用含10%FBS 的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并調(diào)整濃度，1×106個(gè)/孔加入6 孔板，培養(yǎng)12 h 后更換培養(yǎng)基，分別在相應(yīng)孔中加入LPS（100 ng/ml）+ IFN-γ（10 ng/ml）誘導(dǎo)極化為M1 型巨噬細(xì)胞，加入IL-4（20 ng/ml）+IL-13（10 ng/ml）誘導(dǎo)極化為M2 型巨噬細(xì)胞，M0 對(duì)照組中加入等量PBS 培養(yǎng)24 h，收集上清及細(xì)胞待測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型 胰酶消化貼壁細(xì)胞，離心棄上清，加入破膜液混勻，冰上破膜25 min，加入配好的緩沖液，離心棄上清，加入流式緩沖液100 μl，加入相應(yīng)流式抗體（M1：CD80、CD86；M2：CD206）混勻，4 ℃避光孵育30 min，加入緩沖液2 ml洗滌2 次，離心棄上清，每管加入300 μl流式緩沖液重懸細(xì)胞，過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18、TGF-β水平 按照說(shuō)明書(shū)設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔，蓋上封板膜37 ℃溫育60 min，棄去液體，甩干，洗滌5 次，加入顯色劑A 液和B 液，避光孵育 15 min，加入終止液，15 min 內(nèi)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD 值，空白孔調(diào)零，讀出A值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程后代入樣本A值計(jì)算IL-1β、IL-18及TGF-β濃度。

1.2.4 PI 染色和流式細(xì)胞術(shù)觀察各組巨噬細(xì)胞焦亡程度 將誘導(dǎo)24 h的M0、M1和M2型巨噬細(xì)胞去上清，PBS 洗2 次，加入新的培養(yǎng)基，取1/10 培養(yǎng)基的PI（20 μg/ml）溶液加入各孔，37 ℃培養(yǎng)10 min，PBS 洗2 次，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及染色情況并拍照。收集6 孔板中的細(xì)胞至2 ml EP 管，離心棄上清，加入1 ml 流式緩沖液輕柔重懸細(xì)胞，離心棄上清，加入200 μl緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl PI（100 μg/ml）室溫孵育15 min，轉(zhuǎn)至流式管，再加入100 μl緩沖液混勻，上機(jī)檢測(cè)各組焦亡細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.2.5 Western blot 檢測(cè)焦亡蛋白水平 收集M0、M1 和M2 型巨噬細(xì)胞，PBS 洗2 次，加入RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測(cè)蛋白濃度，取等量蛋白上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗caspase-1（1∶1 000）、caspase-11（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）和內(nèi)參抗體4 ℃避光孵育過(guò)夜，1×TBS 洗3次，10 min/次，加入熒光二抗（1∶10 000）避光搖床室溫孵育1 h，洗膜3次，10 min/次，Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀掃描蛋白條帶，Image J 軟件分析結(jié)果，目的蛋白表達(dá)=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.2.6 RT-PCR 測(cè)焦亡因子mRNA 水平 Trizol 法提取純化M0、M1、M2 型巨噬細(xì)胞總RNA，采用 Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA 第一鏈，以GAPDH 為內(nèi)參，F(xiàn)ast-Start Universal SYBR Green Master（Rox） 處理樣本并上機(jī)檢測(cè)焦亡標(biāo)志指標(biāo)caspase-1、caspase-11 和GSDMD mRNA水平。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物序列Fig.1 RT-PCR primer sequences

1.2.7 LDH 檢測(cè)細(xì)胞活性 取各組經(jīng)過(guò)處理的細(xì)胞上清，按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組樣本450 nm 處OD 值，并計(jì)算各組乳酸脫氫酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析進(jìn)行組間比較，數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用FlowJo v10、GraphPad Prism7.0 及Image J 軟件進(jìn)行圖片采集和處理。

2 結(jié)果

2.1 M0 型巨噬細(xì)胞極化為不同表型后形態(tài)學(xué)改變 倒置相差熒光顯微鏡觀察到M0 巨噬細(xì)胞形態(tài)飽滿，大小均一，大部分細(xì)胞呈圓形或橢圓形，團(tuán)聚生長(zhǎng)較明顯（圖1A）；LPS+IFN-γ 刺激24 h 后，誘導(dǎo)分化后的M1 型巨噬細(xì)胞形態(tài)更為多樣，部分細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞膜上突起（偽足）明顯，有的細(xì)長(zhǎng)、有的短小，數(shù)量多且呈放射狀（圖1B）；IL-4+IL-13刺激24 h 后，誘導(dǎo)分化的M2 型巨噬細(xì)胞大部分呈橢圓形或梭形，與M1相比偽足較短且數(shù)量少（圖1C）。

圖1 顯微鏡下各組巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（×40）Fig.1 Morphological manifestations of macrophages in each group under microscope （×40）

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1、M2型巨噬細(xì)胞特異性分子表達(dá) CD80 和CD86 分子表達(dá)是判斷M1 型巨噬細(xì)胞分化情況的特異性指標(biāo)，如圖2所示，未分化的M0型細(xì)胞表面CD80和CD86表達(dá)均＜0.5%，而分化為M1 型巨噬細(xì)胞后，CD80 和CD86 表達(dá)明顯上升，分別達(dá)到（78.20±3.29）%和（77.30±7.21）%。常用于鑒定M2 型巨噬細(xì)胞分化情況的特異性分子為CD206，未誘導(dǎo)的M0型細(xì)胞內(nèi)CD206分子表達(dá)基本為陰性（＜0.5%），而在M2型細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加， 為（82.61±7.12）%，說(shuō)明巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化成功。

圖2 M1/M2巨噬細(xì)胞特異性分子表達(dá)Fig.2 Specific molecular expression of M1/M2 macrophages

2.3 各組細(xì)胞上層清中炎癥因子IL-1β、IL-18 及TGF-β 水平變化 ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與M0 型巨噬細(xì)胞相比，M1、M2 型巨噬細(xì)胞上清中促炎因子IL-1β和IL-18 含量升高（P＜0.05）；與M0、M1 型相比，M2型巨噬細(xì)胞上清中抑炎因子TGF-β 顯著增加（P＜0.05，圖3）。表明M1 和M2 型誘導(dǎo)極化成功，且M1型巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)更為明顯，反映M1 型巨噬細(xì)胞焦亡程度更為明顯。

圖3 各組巨噬細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-18及TGF-β表達(dá)Fig.3 Expressions of inflammatory factors IL-1β， IL-18 and TGF-β in supernatant of macrophages in each group

2.4 PI 染色定性和流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)各型巨噬細(xì)胞焦亡陽(yáng)性率 倒置熒光顯微鏡下觀察PI 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與M0、M2型巨噬細(xì)胞相比，M1 型巨噬細(xì)胞PI 染色呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖4A）；M1 型細(xì)胞PI 染色陽(yáng)性率也明顯高于M0、M2 型細(xì)胞（圖4B）。表明M0、M1和M2型巨噬細(xì)胞均出現(xiàn)焦亡現(xiàn)象，但LPS+IFN-γ刺激誘導(dǎo)分化的M1型巨噬細(xì)胞更為顯著。

圖4 各型巨噬細(xì)胞焦亡陽(yáng)性率Fig.4 Positive rate of pyrophages in various types of macrophages

2.5 Western blot 檢測(cè)各型巨噬細(xì)胞焦亡蛋白表達(dá) caspase-1 和caspase-11 分別是介導(dǎo)焦亡經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑的關(guān)鍵分子。Western blot 結(jié)果顯示，M1 型巨噬細(xì)胞，caspase-1 和caspase-11 蛋白表達(dá)明顯高于M0 和M2 型（圖5），而GSDMD 蛋白在 三者中表達(dá)差異最小。

圖5 各型巨噬細(xì)胞caspase-1/-11和GSDMD蛋白表達(dá)Fig.5 Expressions of caspase-1/-11 and GSDMD proteins in various types of macrophages

2.6 RT-PCR 檢測(cè)各型巨噬細(xì)胞焦亡基因水平 RT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅加PBS 處理的M0 型巨噬細(xì)胞和IL-4+IL-13 刺激誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞焦亡目的基因caspase-1、caspase-11 和GSDMD 表達(dá)降低，且兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而LPS+IFN-γ刺激誘導(dǎo)的M1 型巨噬細(xì)胞caspase-1、caspase-11、 GSDMD mRNA 表達(dá)均明顯高于M0 和M2 組（P＜0.05，圖6）。

圖6 各型巨噬細(xì)胞caspase-1/-11和GSDMD mRNA表達(dá)Fig.6 Expressions of caspase-1/-11 and GSDMD mRNA in various types of macrophages

2.7 LDH 檢測(cè)各型巨噬細(xì)胞活性 各組細(xì)胞上清中LDH釋放試驗(yàn)顯示：與M0組相比，M1、M2組細(xì)胞LDH 釋放增加（圖7），提示細(xì)胞糖酵解增高，M1 型巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡的細(xì)胞占比較高。

圖7 各型巨噬細(xì)胞上清中LDH釋放量Fig.7 Release of LDH in supernatant of various types of macrophages

3 討論

巨噬細(xì)胞是一種體內(nèi)分布廣泛的固有免疫細(xì)胞，其極化與多種疾病發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞極化后，促炎M1 型和抗炎M2 型比例失衡導(dǎo)致局部或全身炎癥微環(huán)境失衡，引發(fā)“炎癥因子風(fēng)暴”，甚至導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。巨噬細(xì)胞極化在微生物（細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)）感染、ALI/ARDS、腫瘤、代謝性疾?。▌?dòng)脈粥樣硬化、肥胖、糖尿?。┘白陨砻庖咝约膊。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等）等發(fā)生發(fā)展中廣泛存在［21-26］，深入了解巨噬細(xì)胞極化在這些疾病中的作用機(jī)制，有望通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2平衡控制和預(yù)防這些疾病發(fā)生。

近年細(xì)胞焦亡逐漸成為程序性死亡領(lǐng)域研究熱點(diǎn)，也是目前炎癥反應(yīng)機(jī)制研究新熱點(diǎn)，與細(xì)胞凋亡和壞死不同的是，焦亡是一種依賴于gasdermin家族蛋白的炎癥性細(xì)胞死亡，而GSDMD 是焦亡最終執(zhí)行蛋白，其剪切體活化也是焦亡發(fā)生的標(biāo)志［18］。焦亡在機(jī)體中的作用是把雙刃劍，細(xì)胞焦亡過(guò)程中釋放的IL-1β 和IL-18 是內(nèi)源性免疫因子，可引起發(fā)熱和刺激免疫細(xì)胞活化，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分泌抗體，加速免疫應(yīng)答以抵抗病原體入侵，從而促進(jìn)病原體清除，但I(xiàn)L-1β 和IL-18 釋放失控會(huì)導(dǎo)致級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，甚至導(dǎo)致全身免疫性疾?。?7-29］。目前已有研究表明細(xì)胞焦亡在炎癥性疾病、敗血癥、ALI/ARDS、癌癥、心血管疾病、免疫性疾病和代謝性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［30-36］。

巨噬細(xì)胞極化和焦亡存在許多相似之處，如兩者均與炎癥反應(yīng)發(fā)生有關(guān)，反應(yīng)過(guò)程失控可導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)放大；兩者均可導(dǎo)致多種疾病，且這些疾病均與炎癥相關(guān)；兩者對(duì)機(jī)體均具有雙重意義，既可增強(qiáng)機(jī)體防御功能起保護(hù)作用，又可導(dǎo)致機(jī)體正常組織自我損傷。如能證實(shí)巨噬細(xì)胞極化與焦亡的關(guān)系，通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，尤其是靶向抑制M1型巨噬細(xì)胞極化，或許能抑制焦亡發(fā)生發(fā)展；反之，亦能通過(guò)阻斷焦亡的經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑平衡M1/M2 比例，從而緩解局部甚至全身炎癥反應(yīng)，最終找到更多治療極化和焦亡相關(guān)疾病的新方法。

本研究采用LPS+IFN-γ 誘導(dǎo)M0 型巨噬細(xì)胞極化為M1 型，IL-4+IL-13 誘導(dǎo)M0 型巨噬細(xì)胞極化為M2 型，是體外誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化最主要的方法［37-38］；隨后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)M1 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD80 和CD86 表達(dá)，M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD206 表達(dá)［38-39］，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)極化后的M1 型巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)與M0 和M2 型差異顯著，M1 型細(xì)胞表面?zhèn)巫愣嗲壹?xì)長(zhǎng)，與M1 型巨噬細(xì)胞攝取病原微生物和抗原提呈功能相符，且流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也表明此次M1、M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化成功。而關(guān)于巨噬細(xì)胞極化后的形態(tài)學(xué)改變，曾有文章報(bào)道人巨噬細(xì)胞極化后形態(tài)學(xué)改變［40］，但小鼠中的變化尚未見(jiàn)文章報(bào)道。本研究結(jié)果可知，M0、M1、M2型巨噬細(xì)胞均可出現(xiàn)焦亡；但與M0 和M2 型相比，M1型巨噬細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18 和LDH 水平均上升，PI 染色陽(yáng)性細(xì)胞比例提高，焦亡相關(guān)指標(biāo)caspase-1、caspase-11 和GSDMD mRNA 和蛋白水平提高，證實(shí)M1 型巨噬細(xì)胞焦亡程度更為顯著，且在這一過(guò)程中，經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑均可激活。此外，根據(jù)RT-PCR 和Western blot caspase-11 表達(dá)量結(jié)果推測(cè)，M1型巨噬細(xì)胞焦亡可能以非經(jīng)典途徑為主，對(duì)其進(jìn)行干預(yù)或許可阻斷巨噬細(xì)胞焦亡，進(jìn)而減輕各種疾病中炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)擴(kuò)大和失衡，但這一設(shè)想有待采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證。

綜上，LPS+IFN-γ 和IL-4+IL-13 可分別成功誘導(dǎo)M0 型巨噬細(xì)胞向 M1 和M2 型極化，且極化后的M1型形態(tài)學(xué)與M0、M2型差異顯著；M0、M1和M2型巨噬細(xì)胞均可發(fā)生焦亡，M1 型最為顯著；LPS 導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞焦亡以非經(jīng)典途徑為主。