高粱類缺鉀癥狀種質(zhì)礦質(zhì)元素含量分析及基因定位

朱振興，曲匡正，李 丹，王春語，白春明，陸曉春

(遼寧省作物分子改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，沈陽遼寧 110161)

高粱是全球五大作物之一，在我國也是重要的雜糧作物[1]。高粱具有耐瘠薄、耐旱、耐鹽等特性，一般種植于邊際土地上，對利用瘠薄、干旱、鹽堿的土地有重要影響[2]。另一方面，高粱在我國白酒釀造、國民膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整及扶貧工作中占有重要地位[3]。鉀是植物三大重要元素之一，是植物細(xì)胞中主要的無機(jī)離子，在干質(zhì)量中最高能占10%[4]。鉀離子在植物體內(nèi)作用廣泛，對植物的生長、發(fā)育、代謝、抗性等方面都有重要影響。鉀離子參與一些酶的激活、維持蛋白的合成、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH值的動態(tài)平衡等過程[5]。還參與韌皮部運(yùn)輸有機(jī)溶液，如參與蔗糖從地上運(yùn)輸?shù)礁康倪^程中，或是運(yùn)輸?shù)焦麑?shí)等一些“庫”組織的過程中起重要的作用[6]。在調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓、調(diào)控滲透壓的變化、維持細(xì)胞電荷平衡，影響細(xì)胞的生長，影響細(xì)胞對環(huán)境的反應(yīng)，如氣孔運(yùn)動、向光性、向地性和細(xì)胞伸長等[7]。

根系是植物吸收鉀的主要組織器官，從根系表皮和皮層細(xì)胞吸收鉀，然后運(yùn)輸?shù)街兄?，通過中柱將鉀養(yǎng)分輸送到需要的組織和器官[8]。由于脂質(zhì)雙層細(xì)胞膜是不可滲透離子，所以鉀必須通過膜上的特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白才能進(jìn)入根中[9]?，F(xiàn)在一般認(rèn)為高親和性鉀吸收系統(tǒng)主要是由質(zhì)膜上的鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體參與，如HAK5鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)體[10]，可能也有離子通道參與；而低親和性鉀吸收系統(tǒng)主要是質(zhì)膜上的鉀離子通道，如離子通道蛋白AKT1[11]，一般被認(rèn)為是被動運(yùn)輸過程，不需要消耗ATP。位于膜上的鉀離子通道可能構(gòu)成了低親和性鉀吸收系統(tǒng)[12]。另一方面，鉀吸收系統(tǒng)也受轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控。鉀離子的吸收利用分子機(jī)制在水稻中和擬南芥中有相對深入的研究，但在高粱中基本不清楚[13]。鉀肥相對價格較貴，當(dāng)季利用率約為50%[14]，其余的鉀肥被浪費(fèi)并排放到環(huán)境中，不經(jīng)濟(jì)也不環(huán)保。作物缺鉀時，葉片上一般可見發(fā)黃、褐色斑點(diǎn)，葉尖、葉緣呈現(xiàn)褐色小斑點(diǎn)，然后逐步褐變枯死，而且老葉比新葉癥狀更嚴(yán)重，最終嚴(yán)重影響產(chǎn)量。因此通過鑒定類缺鉀突變體或種質(zhì)，發(fā)掘與鉀吸收利用相關(guān)的基因，對培育鉀養(yǎng)分高效高粱有重要作用。

一般鉀吸收利用分子途徑知識來自突變體研究較多，而自然種質(zhì)的報道較少。從國際半干旱作物研究所引進(jìn)的高粱核心種質(zhì)資源中[15]，有1份高粱種質(zhì)編號8-10在拔節(jié)后，葉尖及葉片邊緣逐漸出現(xiàn)紫褐色斑點(diǎn)，然后逐步壞死，類似于缺鉀癥狀。而正常生長的高粱葉片在籽粒成熟之前一般并不會產(chǎn)生紫褐色壞死斑點(diǎn)。從2012—2015年連續(xù)3年的田間正常種植條件下，表型觀察高粱種質(zhì) 8-10 葉片的表現(xiàn)穩(wěn)定、一致，因此確定這是一份特異的類缺鉀癥狀種質(zhì)資源。本研究對高粱類缺鉀癥狀種質(zhì)8-10進(jìn)行表型和不同位置葉片進(jìn)行礦質(zhì)含量的分析，組配F2群體，研究該性狀的遺傳特性，并通過BSA-Seq高通量測序?qū)υ撔誀羁刂苹蜻M(jìn)行粗定位。

1 材料與方法

1.1 材料與田間種植條件

高粱微核心種質(zhì)材料8-10，以參考基因組測序品種BTX623作為參照品種。田間種植條件，為一般高粱田間種植條件，正常進(jìn)行澆水、施肥、病蟲害管理等。種植行距為40 cm，株距為20 cm，行長為 2 m。

1.2 礦質(zhì)含量測定

在開花時期，取BTX623以及8-10不同位置的新鮮葉片，每個位置葉片取2株長勢基本一致植株同位置的葉片混在一起，計為1個樣品，3個生物學(xué)重復(fù)，即將6株苗的葉片進(jìn)行烘干至恒質(zhì)量。烘干過程如下，新鮮葉片首先120 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘至恒質(zhì)量，一般4 d即可。在進(jìn)行礦質(zhì)含量分析時需要注意的是，要用陶瓷剪刀將樣品進(jìn)行剪碎(避免鐵元素或其他金屬元素污染)。取碎的混勻干樣葉片約0.1 g，加入6 mL濃硝酸和2 mL濃H2O2(濃度一般為30%)，過夜預(yù)硝化，然后用微波硝煮儀(美國CEM公司MARS6)按照說明書進(jìn)行消化至澄清液體，冷卻后開蓋，其后對消化管進(jìn)行趕酸至體積約0.5 mL，最終定容至25 mL，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)(美國珀金埃爾默公司Optima 8000)進(jìn)行礦質(zhì)元素含量的測定。

1.3 基因組DNA提取以及BSA-Seq高通量測序分析

首先進(jìn)行定位群體的構(gòu)建，將葉片顏色正常品種BTX623與8-10類缺鉀癥狀種質(zhì)進(jìn)行雜交獲得F1，然后套袋自交得到F2。將F2群體植株種植于田間，正常施肥管理。在田間F2群體開花后大概2周，采集葉片顏色正常的表型植株50株，典型類缺鉀癥狀葉植株50株，以及父母本2個材料進(jìn)行基因組DNA提取。由于高通量測序?qū)蚪MDNA條帶質(zhì)量要求高，DNA提取采用試劑盒法(天根生物科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒DP320)，所用新鮮葉片大概100 mg，按照說明書進(jìn)行提取，然后用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，要求條帶清晰、無拖尾；用核苷酸紫外分光光度計Nanodrop測定DNA的濃度(美國賽默飛世爾科技公司)以及D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm，確保比值在1.8～2.0之間。BSA-Seq測序時2個DNA混池要求均勻混合每個樣品，每個樣品濃度要求大于50 ng/μL，總量為100 ng，然后將檢驗(yàn)合格的DNA樣品送樣至北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序分析。

本研究利用北京百邁客生物科技有限公司自主研發(fā)的特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測序(specific locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq)技術(shù)[16]對高粱類缺鉀癥狀F2遺傳分離群體(2個親本和50+50的混池)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，最終獲得與類缺鉀性狀緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和候選區(qū)域。SLAF高通量測序分析流程簡述如下：首先通過高粱基因組進(jìn)行方案預(yù)測，選擇HaeⅢ+RsaⅠ 酶進(jìn)行酶切，SLAF標(biāo)簽長度選擇在364～414 bp 之間，預(yù)測到113 111個SLAF標(biāo)簽，SLAF標(biāo)簽在基因組上基本分布均勻，位于重復(fù)序列區(qū)的SLAF標(biāo)簽比例為8.77%。酶切完后進(jìn)行建庫，基因組DNA片段經(jīng)過加接頭、PCR擴(kuò)增等，然后進(jìn)行上機(jī)測序，其后進(jìn)行生物信息學(xué)分析。對獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭序列等序列的過濾，然后得到clean data，利用BWA軟件進(jìn)行比對到參考基因BTX623上，然后進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)的檢測，依據(jù)檢測出的SNP位點(diǎn)，計算SNP-index差值，主要是尋找混池之間基因型頻率的顯著差異，用Δ(SNP-index)統(tǒng)計。標(biāo)記與性狀關(guān)聯(lián)度越強(qiáng)，Δ(SNP-index)越接近于1。最終挑出顯著差異的區(qū)域，定位候選區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱8-10葉片表型觀察

由于該種質(zhì)來源于國際半干旱作物研究所引進(jìn)的高粱核心種質(zhì)資源，在對照方面，選取BTX623參考基因組測序品種作為比較對象。高粱8-10種質(zhì)在苗期拔節(jié)前，葉片上幾乎無紫褐色壞死斑點(diǎn)，與其他品種如BTX623并無顯著差異。之后葉尖、葉片邊緣逐步出現(xiàn)紫褐色壞死斑點(diǎn)，到了開花后葉片中就出現(xiàn)了大量紫褐色壞死斑點(diǎn)；在老葉中越來越多，而且是從葉尖到邊緣逐漸壞死。如圖1所示，旗葉到第7葉，紫褐色壞死斑點(diǎn)呈現(xiàn)增多的趨勢，特別是新葉中少，老葉中多。而一般的高粱種質(zhì)葉片如參照品種BTX623品種在此時期葉片不論是旗葉還是其他位置葉片葉尖、葉緣都沒出現(xiàn)紫褐色壞死斑點(diǎn)。

2.2 高粱8-10不同位置葉片礦質(zhì)含量分析

由于高粱8-10種質(zhì)葉片葉尖、葉緣出現(xiàn)紫褐色壞死斑點(diǎn)，類似于缺鉀的癥狀，而且符合老葉癥狀嚴(yán)重，新葉輕的特性。為驗(yàn)證該紫褐壞死斑點(diǎn)的產(chǎn)生是否與礦質(zhì)元素含量的影響有關(guān)，特別是那些可移動的礦質(zhì)元素，如鎂、鉀、鈣、磷、鈉、鐵、錳、銅等。將8-10與BTX623最上面的3片葉片中礦質(zhì)元素含量(旗葉為L1，往下依次為L2、L3)進(jìn)行比較可知，鉀、鎂以及鈣元素在3個葉片之間的變化趨勢與BTX623有較大的不同，鉀含量在8-10倒3葉中較倒2葉降低了25.3%；而鎂、鈣離子的積累模式與BTX623葉也不同，特別是在倒3葉中較倒2葉中分別增加了72.1%以及57.8%；其他元素如磷、鈉、鐵等元素在不同葉片中的分布模式與BTX623差異并不明顯(圖2)。

2.3 遺傳分析

將高粱類缺鉀種質(zhì)8-10與BTX623進(jìn)行雜交獲得F1，F(xiàn)1植株葉片表現(xiàn)正常，無褐紫色壞死斑點(diǎn)，表明該性狀控制基因?qū)儆陔[性控制基因。F1自交得到F2群體，播種于田間并進(jìn)行表型的觀察。在植株開花后約10 d，進(jìn)行褐紫色壞死斑點(diǎn)的統(tǒng)計。將葉片上的褐紫色壞死斑點(diǎn)的數(shù)量分為4個等級：1級，葉片無或幾乎無褐紫色壞死斑點(diǎn)；2級，葉片中少量褐紫色壞死斑點(diǎn)；3級，中等量褐紫色壞死斑點(diǎn)；4級，褐紫色壞死斑點(diǎn)數(shù)量與8-10種質(zhì)相似。在F2中進(jìn)行褐紫色壞死斑點(diǎn)性狀等級調(diào)查，結(jié)果表明，葉片表現(xiàn)為無或幾乎無褐紫色壞死斑點(diǎn)的植株有349株(W型)，而攜帶褐紫色壞死斑點(diǎn)的植株3個類型合計為312株(B+、B++以及B+++)。葉片W型植株與葉片攜帶B型的植株數(shù)量進(jìn)行9∶7分離比例的Pearson卡方測試，結(jié)果表明P值大于0.05，符合9∶7分離比例(表1)。該分離比例表明，褐紫色壞死斑點(diǎn)控制基因受2對隱性基因控制。但在有褐紫色壞死斑點(diǎn)斑點(diǎn)的植株中，并不符合2個沒有相互作用的隱性基因的遺傳規(guī)律，表明這2個基因之間很可能是存在互作關(guān)系的。

表1 F2群體葉片斑點(diǎn)的遺傳分析結(jié)果

2.4 BSA-Seq高通量測序分析

在高粱類缺鉀種質(zhì)8-10與BTX623進(jìn)行雜交獲得的F2群體中，挑選極端表型個體各50株，即50株F2植株中葉片表型與8-10一致，50株F2植株葉片表型與BTX623一樣，完全無褐紫色壞死斑點(diǎn)以及2個親本。然后提取基因組DNA，構(gòu)建DNA混池，建庫、測序以及生物信息學(xué)分析。對得到的17 847個候選多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，通過SNP-index方法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，擬合后的關(guān)聯(lián)閾值為 0.495 766，共獲得868個與性狀顯著相關(guān)的SLAF標(biāo)記，將該基因關(guān)聯(lián)到第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間上(物理位置為 51 504 457～59 110 341 bp)，關(guān)聯(lián)區(qū)間內(nèi)的SLAF標(biāo)記為179個，該區(qū)間內(nèi)預(yù)測有885個基因(圖3)。

由于上述分析得到的關(guān)聯(lián)區(qū)域較大，因?yàn)樵摵肿仙珘乃腊唿c(diǎn)葉片控制基因?yàn)殡[性基因，可將根據(jù)具有隱性性狀表型的混池對得到的關(guān)聯(lián)侯選區(qū)域進(jìn)一步分析，將關(guān)聯(lián)區(qū)域細(xì)化，進(jìn)一步縮小目標(biāo)基因范圍。選擇SNP-index(aa)>0.9的性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記，進(jìn)一步細(xì)化了關(guān)聯(lián)侯選區(qū)域共定位到14個熱點(diǎn)區(qū)域，熱點(diǎn)區(qū)域大小約為2.88 Mb，關(guān)聯(lián)到76個分子標(biāo)記，該區(qū)間內(nèi)預(yù)測有317個基因(表2)。

表2 基因關(guān)聯(lián)熱點(diǎn)區(qū)域匯總

3 討論

鉀元素是作物生長所必需的三大元素之一，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。作物在缺鉀時，會影響葉綠素合成，嚴(yán)重時最終影響產(chǎn)量[17-18]。鉀肥價格相對較高，田間當(dāng)季利用率不高，培育鉀高效作物，提高作物對鉀肥的吸收、利用效率，是非常重要的途徑[19]，挖掘與鉀吸收利用相關(guān)的基因有重要的意義。本研究利用高粱核心種質(zhì)資源中的1份類缺鉀癥狀種質(zhì)，其葉尖和邊緣有較多褐紫色壞死斑點(diǎn)，而且呈現(xiàn)老葉癥狀重、新葉輕的特點(diǎn)。對不同位置的葉片進(jìn)行了礦質(zhì)元素含量的分析，發(fā)現(xiàn)2個元素在老葉與新葉中的積累模式與BTX623不同。對該種質(zhì)葉片類缺鉀表型進(jìn)行了遺傳分析和定位，將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間內(nèi)。

現(xiàn)在鉀養(yǎng)分相關(guān)分子途徑研究結(jié)果，一般來自人工誘變突變體或是來自正向遺傳學(xué)研究，鮮有來源于自然種質(zhì)研究[20]。本研究中的類缺鉀癥狀種質(zhì)8-10，從不同位置葉片離子含量測定的結(jié)果來看，8-10中倒3葉中鉀離子含量最低，較倒2葉降低了25.3%(圖2)；而且鉀離子在不同位置葉片中的分布與BTX623也不同，在BTX623中這個時期鉀離子在前3個葉片中的含量幾乎無差異，而在8-10中，前2片葉子鉀離子含量也無差異，而倒3葉鉀含量明顯下降；鈣離子和鎂元素的含量在8-10中倒3葉中明顯增加，而前2片葉子中含量幾乎不變。8-10中倒3葉已出現(xiàn)可見的褐紫色壞死斑點(diǎn)，而倒1和倒2葉沒有明顯的斑點(diǎn)(圖1-B)。植物在缺鉀條件下，一般會促進(jìn)其他陽離子的吸收，如鈣、鎂，從而緩解缺鉀的影響[21-22]。本研究中在8-10倒3葉中鉀元素含量較倒2葉明顯下降，與之對應(yīng)的是鈣和鎂含量的大幅度增加。同樣為可移動元素的大量元素磷元素在此時期8-10種質(zhì)中的前3片葉片中幾乎無變化，表明植株在這個時期老葉中的可移動元素并未向新葉中轉(zhuǎn)移，葉片中缺鉀很可能是8-10種質(zhì)顯示類缺鉀癥狀的直接原因。

從遺傳分析上看，該類缺鉀表型符合2對隱性基因控制的分離比例，但是并不符合2對無互作的基因分離比例，因而該類缺鉀癥狀控制的2對基因間很可能是存在互作關(guān)系的，至于互作的方式需要進(jìn)一步深入精細(xì)定位、克隆基因才能闡述清楚。值得注意的是，我們利用BSA-Seq將該基因定位在第4條染色體上7.61 Mb的區(qū)間內(nèi)，到底控制類缺鉀癥狀的2個基因都在這一區(qū)間內(nèi)，還是一個在第4條染色體上，另一個基因分布在其他染色上暫時無法確定。因?yàn)楫吘笲SA-Seq高通量測序定位所使用的極端個體，挑選的都是與8-10個葉片表型高度一致的個體，那些表型相對弱的個體暫時并未使用到定位分析中。因此下一步需要精細(xì)定位使用不同表型個體將該基因克隆出來。另一方面，由于8-10是來源于自然種質(zhì)的材料，BTX623只能作為一般參照品種，并不能直接準(zhǔn)確進(jìn)行該類缺鉀癥狀控制基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀影響的評估，將來需要構(gòu)建近等基因系材料，從而進(jìn)行該基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀影響的精確分析。

4 結(jié)論

本研究從國際高粱核心種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)了1份葉尖褐變逐漸壞死的類缺鉀癥狀種質(zhì)。表型性狀分析發(fā)現(xiàn)，該類缺鉀癥狀種質(zhì)在苗期葉片較其他品種如BTX623并無顯著差異；后期葉尖、葉片邊緣逐漸出現(xiàn)褐紫色壞死斑點(diǎn)，而且老葉癥狀重于新葉；不同位置葉片礦質(zhì)元素含量分析結(jié)果表明，鉀、鎂和鈣這3個礦質(zhì)元素在新老葉片中的積累模式與BTX623有明顯差異。遺傳分析結(jié)果表明，該性狀受2個隱性基因控制。BSA-Seq高通量測序定位，最終將該性狀控制基因定位于第4條染色體上7.61 Mb區(qū)間內(nèi)。該特異種質(zhì)高粱的研究，為高粱鉀相關(guān)分子機(jī)制研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。