基于流式細(xì)胞術(shù)的北美冬青基因組大小測定

李 皎，周 鵬，張 強(qiáng)**，張 敏*

（1.南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院/南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 江蘇 南京 210037；2.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153）

北美冬青（Ilex verticillata）又名輪生冬青、美洲冬青，為冬青科冬青屬多年生落葉灌木［1］，原產(chǎn)美國東北部，樹型美觀，果實(shí)成熟后呈紅色，亮麗奪目，經(jīng)冬不落，觀賞價(jià)值極高。目前約有30多個(gè)栽培品種在歐美觀賞植物市場上占有重要地位。近年來，北美冬青在我國普遍引種，其引種范圍覆蓋黃河流域、長江流域、東北和華北等大部分地區(qū)［2］，園藝方面逐漸得到推廣應(yīng)用。挖掘遺傳信息是植物育種研究中的重要基礎(chǔ)工作，而北美冬青基因與基因組層面的研究極少，制約了北美冬青進(jìn)一步有效利用。

基因組大小是物種遺傳信息的重要參數(shù)，在基因序列分析、種群基因組多樣性和進(jìn)化演變等研究中占有重要地位?；蚪M大小的獲取對于構(gòu)建物種系統(tǒng)進(jìn)化樹、鑒定雜交種、分析種間親緣關(guān)系有著重要意義［3］。C值（C-value）是指生物體不復(fù)制的單倍體細(xì)胞核所含DNA的含量，常用于反映物種基因組的大小。基因組大小和C值的測定方法主要有Feulgen分光光度法和流式細(xì)胞術(shù)法（Flow cytometry，F(xiàn)CM）［4-6］。流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對懸浮的單細(xì)胞進(jìn)行高速分析和分選的技術(shù)，因其具有分析速度高、多參數(shù)、高精度、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)已成為基因組測序前預(yù)測植物基因組大小的首選方法［7-9］。此外，在植物學(xué)研究領(lǐng)域中，流式細(xì)胞術(shù)還成功用于植物染色體倍性鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等［10-12］。

目前，流式細(xì)胞術(shù)已被廣泛用于植物基因組大小與核DNA含量測定，如桂花（Osmanthus fra-grans）［3］、烏 飯 樹（Vaccinium bracteatum）［13］、核 桃（Juglans regia）［14］、杏（Prunus armeniaca）［15］、茉莉花（Jasminum sambac）［16］、火 龍 果（Hylocereus undatus）［17］等。而有關(guān)冬青屬植物基因組大小研究的報(bào)道極少，姚昕等人首次報(bào)道了西南地區(qū)廣布且觀賞價(jià)值較高的多脈冬青（I.polyneura）的全基因組大小為727.1 Mb［18］。作為廣泛栽培的園藝種，關(guān)于北美冬青品種基因組大小及C值的研究尚未見報(bào)道。本研究選用國內(nèi)商業(yè)價(jià)值較高、栽培范圍較廣的10個(gè)北美冬青品種作為試驗(yàn)材料，采用流式細(xì)胞術(shù)對北美冬青品種進(jìn)行2C值檢測分析及基因組大小估測，以期為北美冬青種質(zhì)資源鑒定、基因組學(xué)研究以及新品種培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為北美冬青的10個(gè)品種（表1），均采自江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國家觀賞冬青種質(zhì)資源庫。采集剛抽出的嫩葉，并選取已知基因組大小的二倍體水稻‘日本晴’（Oryza sativasubsp.japonica cv.Nipponbare）和二倍體大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）作為標(biāo)樣。水稻‘日本晴’種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，營養(yǎng)液按照“國際水稻所營養(yǎng)液配方”配置。

表1 供試的10個(gè)北美冬青品種Tab.1 Introduction of germplasm resources of 10 I.verticillata cultivars

1.2 方法

1.2.1 解離液的選擇與熒光染料配置

流式細(xì)胞術(shù)中，細(xì)胞解離液的作用是將完整的細(xì)胞核從細(xì)胞中游離出來，選擇合適的解離液能使樣品的分析更加準(zhǔn)確可靠［3，13-14，17］。本試驗(yàn)采用Tris-MgCl2、GPB、LB01、Galbraith’s和WPB 5種解離液［19］制備細(xì)胞核懸液，通過試驗(yàn)選出適合北美冬青的最佳解離液。熒光染液選取碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色液，其濃度為 50 μg /mL（含 RNA酶），配置后在4℃條件下避光保存。

1.2.2 細(xì)胞核懸浮液制備

采集剛萌發(fā)的新生嫩葉，裝入自封袋放置冰盒內(nèi)保存。試驗(yàn)時(shí)，將嫩葉用蒸餾水清洗干凈后擦干。將塑料培養(yǎng)皿置于冰面上，加入1 mL預(yù)冷的解離液，然后剪取待測樣50 mg、標(biāo)樣50 mg放入培養(yǎng)皿，使解離液完全浸沒葉片。用鋒利的刀片快速切碎，時(shí)間約1 ～ 3 min。使用400目濾網(wǎng)過濾至1.5 ml離心管中，冰上孵育5 min后，在4℃條件下800 r / min離心5 min。棄去上清，加入500 μL配置好的PIRNase染液，在4℃條件下避光染色5 ～ 10 min。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測

采用BD Influx 流式細(xì)胞儀對染色后的樣品細(xì)胞核懸浮液進(jìn)行上機(jī)檢測，通過488 nm的激光激發(fā)，收集670 / 30通道的熒光，檢測熒光強(qiáng)度。每次檢測需收集約10 000個(gè)細(xì)胞，3次重復(fù)。采用流式細(xì)胞儀自帶的軟件（BD FACS sortware1.0.0.650軟件）進(jìn)行作圖分析。以已知核DNA含量的水稻‘日本晴’和大豆為參照樣本，通過以下公式計(jì)算得到待測樣品的核DNA含量：目標(biāo)樣品核DNA含量（pg / 2C）= 參考樣本核DNA含量 × 待測樣本平均熒光強(qiáng)度 /參考樣本平均熒光強(qiáng)度，基因組大小根據(jù)1 pg DNA = 978 Mp計(jì)算［20］。檢測分辨率或精確度由G0/ G1峰的變異系數(shù)CV（Coefficient of variance）值來反映，CV（%） = 標(biāo)準(zhǔn)差 / 平均值 × 100%，CV值控制在5%之內(nèi)［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 解離液的選擇

用Tris-MgCl2、GPB、LB01、Galbraith’s和WPB 5種解離液分別制備北美冬青細(xì)胞核懸浮液，上機(jī)測試后，5種解離液具有不同的解離效果。對比后發(fā)現(xiàn)Tris-MgCl2解離液對水稻‘日本晴’和北美冬青的解離效果最好。具體表現(xiàn)為上機(jī)后顆粒收集速度快，顆粒聚集度好，檢測結(jié)果中雜峰少，峰形佳，變異系數(shù)（CV值）在5%以內(nèi)（圖1 - 2）。因此本研究選用Tris-MgCl2解離液制備細(xì)胞核懸液。

2.2 待測樣品的熒光強(qiáng)度范圍確定

在檢測之前需要確定標(biāo)樣，而流式細(xì)胞儀在電壓不同的情況下，同一樣品的流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中峰的位置也具有差距。因此在流式細(xì)胞儀電壓不變的情況下，將標(biāo)樣與待測樣單獨(dú)處理后上機(jī)檢測，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中峰的位置，判斷待測樣相對應(yīng)的標(biāo)樣。以水稻‘日本晴’和樣本單獨(dú)上機(jī)檢測，觀察流式細(xì)胞術(shù)檢測圖中峰的位置，初步確定標(biāo)樣與待測樣本的熒光強(qiáng)度范圍。在同一檢測模板下，水稻‘日本晴’的熒光強(qiáng)度峰值在10 000左右，北美冬青樣本（除 ′Cacapon′、′Red Sprite′和 ′Shaver′）的熒光強(qiáng)度峰值在 21 000左右（圖1）?！銫acapon′、′Red Sprite′ 和 ′Shaver′ 熒光強(qiáng)度峰在50 000左右，由于兩峰數(shù)值差異大、距離遠(yuǎn)，因此，‘日本晴’不適宜作為這3個(gè)北美冬青的標(biāo)樣。當(dāng)選取大豆作為標(biāo)樣時(shí)，大豆的熒光強(qiáng)度峰值在10 000左右，這3個(gè)品種樣本的熒光強(qiáng)度峰值在20 000左右（圖1）。

圖1 水稻‘日本晴’與北美冬青 ′Apollo′、二倍體大豆與北美冬青 ′Shaver′ 的流式細(xì)胞術(shù)檢測分析結(jié)果Fig.1 Flow cytometry analysis results of O.sativa subsp.japonica cv.Nipponbare and I.verticillata ′Apollo ′、G.max （Linn.）Merr.and I.verticillata ′Shaver′

通過以上試驗(yàn)，以水稻‘日本晴’作為北美冬青′Oosterwijk′、′Earlibright′、′Winter Red′、′Winter Gold′、′Apollo′、′Afterglow′ 和 ′Southern Gentleman′的內(nèi)標(biāo)，以大豆作為北美冬青 ′Cacapon′、′Red Sprite′ 和 ′Shaver′ 的內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行混合樣上機(jī)測試。由于核DNA含量與細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度呈正比，根據(jù)初步測定結(jié)果來看，北美冬青的熒光強(qiáng)度峰值均大于內(nèi)標(biāo)的熒光強(qiáng)度峰值，可以推測混合樣上機(jī)后，代表內(nèi)標(biāo)的峰應(yīng)位于流式細(xì)胞術(shù)檢測圖的左側(cè)，而代表北美冬青樣本的峰應(yīng)位于圖的右側(cè)。

2.3 北美冬青基因組大小測定與倍性分析

流式檢測結(jié)果如圖2所示，標(biāo)樣與待測樣的主峰區(qū)分度較好，圖中峰均清晰，說明本方法適用于北美冬青基因組大小測定。根據(jù)兩峰的熒光強(qiáng)度對比，參照水稻‘日本晴’和大豆的峰值及基因組大小計(jì)算北美冬青各品種的基因組大?。ū?），再根據(jù)1 pg DNA=978 Mb，計(jì)算出北美冬青各品種的核DNA含量（2C值）。結(jié)果表明，′Cacapon′、′Red Sprite′和′Shaver′的基因組大小較為相近，均為2 000 Mb左右，核DNA含量在2.10 pg左右；其中′Cacapon′的基因組最大，為2 108.95 Mb，核DNA含量為2.16 pg。而′Oosterwijk′、′Earlibright′、′Winter Red′、′Winter Gold′、′Apollo′、′Afterglow′ 和 ′Southern Gentleman′的基因組大小較為相近，值為800 Mb左右，核DNA含量在 0.80 pg左右；其中 ′Earlibright′ 的基因組最大，為852.99 Mb，核DNA 含量為 0.87 pg，′Southern Gentleman′ 的基因組最小，為728.46 Mb，核DNA含量為0.75 pg。對比各品種與已測全基因組的多脈冬青基因組大?。?27.1 Mb），發(fā)現(xiàn) ′Cacapon′、′Red Sprite′ 和 ′Shaver′ 是多脈冬青基因組大小的 3 倍左右，推測這3個(gè)品種可能是多倍體，其余7個(gè)北美冬青品種是二倍體。

表2 北美冬青樣品流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果Tab.2 Flow cytometry results of I.verticillata samples

本研究中 ′Apollo′ 和 ′Southern Gentleman′ 為雄性品種，其余8個(gè)北美冬青為雌性品種。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來看，雄性品種 ′Apollo′ 和 ′Southern Gentleman′ 基因組大小分別為801.59 Mb和728.46 Mb，平均值為 765.03 Mb；雌性品種中，除 ′Cacapon′、′Red Sprite′和 ′Shaver′ 這三個(gè)多倍體品種外，其余基因組大小平均值為 807.54 Mb。雄性品種 ′Apollo′ 和 ′Southern Gentleman′ 的核 DNA含量分別為 0.82 pg、0.75 pg，平均值為0.79 pg；而雌性品種除三個(gè)多倍體品種外核DNA含量平均值為0.83 pg。

3 結(jié)論與討論

基因組大小是植物的基本屬性，也是植物研究的基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)，目前由于技術(shù)性原因致使這方面的研究較少［19］。本研究對比不同解離液對北美冬青細(xì)胞的解離效果，建立基于流式細(xì)胞術(shù)的北美冬青基因組大小測定方法。測定的10個(gè)北美冬青品種基因組大小范圍在 728.46 Mb ～ 2 108.95 Mb，核DNA含量范圍在0.75 pg ～ 2.16 pg，品種間存在顯著差異。此次測定的10個(gè)北美冬青品種的C值均為首次報(bào)道，不僅豐富了冬青屬植物的C值庫；同時(shí)為同屬植物基因組大小測定提供了技術(shù)參考，以及為后續(xù)破譯冬青基因組的方案選擇奠定基礎(chǔ)。

流式細(xì)胞術(shù)一般以已知基因組大小的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品進(jìn)DNA總量分析來計(jì)算目標(biāo)基因組的大小。流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)準(zhǔn)植物的選擇應(yīng)該具備一定條件，不同植物所需的標(biāo)準(zhǔn)品即內(nèi)參存在差異，常用的標(biāo)準(zhǔn)品有大豆［22］、玉米［16］、水稻［13］、番茄［23］等。研究表明，理想狀態(tài)下的樣本峰值應(yīng)是內(nèi)標(biāo)峰值的兩倍左右［24］。本研究選用水稻‘日本晴’和大豆為內(nèi)標(biāo)，測定后發(fā)現(xiàn)所有樣本的熒光峰值是其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)熒光峰值的2倍左右，且兩峰區(qū)分度良好，單參數(shù)直方圖美觀；表明用已知基因組大小的水稻‘日本晴’和大豆作為內(nèi)標(biāo)來測定冬青基因組大小結(jié)果的準(zhǔn)確性。

流式細(xì)胞術(shù)檢測的成敗和準(zhǔn)確性很大程度上取決于細(xì)胞核懸液制備及熒光染色兩個(gè)步驟，在眾多的影響因素中，裂解液和熒光染料的選擇十分關(guān)鍵［19，25］。針對不同研究對象，采用適合的細(xì)胞核解離液配方、解離和染色方法是流式細(xì)胞術(shù)檢測植物基因組大小的關(guān)鍵。已有研究表明，不同植物采用的解離液存在差異，桂花［3］、烏飯樹［13］、核桃［14］、火龍果［17］分別使用的是 WPB 解離液、GPB解離液、LB01解離液和Tris-MgCl2解離液。本研究中在制備細(xì)胞核懸液時(shí)，Tris-MgCl2解離液制備的細(xì)胞核懸液澄清，上機(jī)檢測后細(xì)胞核數(shù)量多，聚集度好，雜峰少，變異系數(shù)在5%以內(nèi)，說明細(xì)胞核完整性較好，變異系數(shù)低，保證了數(shù)據(jù)的可靠性；而 GPB、LB01、Galbraith’s和WPB 解離液所制備的細(xì)胞核懸液較為渾濁，顏色較深，上機(jī)后測試結(jié)果雜峰多，變異系數(shù)較大；這可能是北美冬青葉片中內(nèi)含物或次生代謝物與解離液反應(yīng)，使得制備的細(xì)胞核懸液較為渾濁［19，25］。樣品測定時(shí)熒光染料的選擇也是成功的關(guān)鍵之一，使用較多的染料是4， 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（4， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）和 PI染液［25］。本研究采用精確度較高的PI染液［25］，染色后上機(jī)檢測，結(jié)果中細(xì)胞核數(shù)量多，聚集度好，說明PI染料可以對北美冬青細(xì)胞核較好的染色。

此外，本研究中的北美冬青均為栽培種，其中雄性品種的基因組大小和核DNA含量均小于雌性品種；而雌性品種中多倍性品種 ′Cacapon′、′Red Sprite′ 和′Shaver′ 的出現(xiàn)可能是在北美冬青栽培品種選育過程中倍性發(fā)生了改變。