桃兒七種子休眠與萌發(fā)機制研究進展

寧蓉春 ，剛?cè)A本 ，王 娜 ，徐文華

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.海東市樂都區(qū)上北山林場，青海 海東 810799；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810008）

桃 兒 七［Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying］是小檗科鬼臼亞科桃兒七屬多年生草本植物，其花美葉奇，根和根莖具有較高的藥用價值［1］。目前資源量稀缺亟待保護已列入嚴重瀕危種群，被《中國物種紅色名錄》、《中國植物紅皮書》和《中國珍稀瀕危植物名錄》收錄，屬于國家二級保護植物［1-2］。桃兒七具有悠久的藥用歷史，最初以“鬼臼”之名記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其根、莖、果實等部位在民間及民族藥物中廣泛使用，果實作為藏藥材稱“奧木塞”，藏族人民有食用的習(xí)慣［3-4］。據(jù)文獻記載：其性溫，味苦、微辛，有毒；具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、祛痰止咳之效；常用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、脘腹冷痛，咳嗽，胎盤不下等癥［3-6］。主要分布于我國陜西太白山區(qū)，甘肅榆中、和政，青海東南部，四川西部，云南德欽、香格里拉及西藏昌都、林芝等地［7-12］。桃兒七對溫度適應(yīng)性很強，適生于寒冷濕潤的環(huán)境，生長于海拔1500 m（湖北羅田）～4300 m（云南中甸大雪山）的高山草叢或林邊［13-14］。

分根繁殖和種子繁殖是桃兒七主要的育苗方式，桃兒七種子有較強的休眠特性，自然條件下其休眠時間長達十個月［15-16］，嚴重阻礙對桃兒七的開發(fā)和利用。目前對桃兒七種子休眠機制方面的系統(tǒng)研究較少，尚未找到高效破除休眠的技術(shù)方法。但隨著現(xiàn)代藥理學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其根莖主要提取物鬼臼毒素在治療尖銳濕疣［17］、抗癌與抗腫瘤［18-20］、抗病毒［21-22］等方面有顯著藥理學(xué)活性，使其市場需求日益增加。因此，本文綜合國內(nèi)外文獻資料及研究進展對桃兒七種子休眠機制與萌發(fā)特性進行綜述，以期明晰桃兒七種子高效萌發(fā)技術(shù)方法，為通過人工規(guī)?；N子種苗種植桃兒七提供可行的技術(shù)方法和科學(xué)的理論指導(dǎo)。

1 桃兒七種子萌發(fā)困難的原因

種子的生命力從旺盛時期經(jīng)歷衰老至死亡，是一個復(fù)雜的量變到質(zhì)變的連續(xù)過程，由不可抗拒的自然法則所決定，當(dāng)種子生理成熟時，便逐漸開始老化，生命力逐漸降低［25］。在理想的貯藏條件下，貯藏時間超過一定限度，種子活力喪失其生命便會終止［23-24］，桃兒七種子在4～6℃下，儲藏1年就會完全失去活性［26，53］。徐正堯等［27］首次發(fā)現(xiàn)桃兒七具有一種適應(yīng)于自花授粉的傳粉機制，整個傳粉受精的過程僅需4～6 h［28］。一般條件下，每個桃兒七果實產(chǎn)生20～150粒種子，其平均結(jié)實率高達61.29%～91.60%［29］，桃兒七種子在自然條件下具有休眠期長，萌發(fā)不良的生理特性，其中種皮、胚乳限制和生理后熟是引起桃兒七種子休眠的主要原因［30］，導(dǎo)致其野生資源量稀缺。一般情況下桃兒七通過種子進行有性繁殖，在良好的土壤及水肥條件下也可通過根狀莖增殖產(chǎn)生的側(cè)芽進行繁殖［27］。

現(xiàn)代研究表明種子休眠的原因主要包括：1、種皮障礙：即種皮厚、硬，阻礙種子對空氣、水分的吸收進而抑制萌發(fā)使其處于休眠狀態(tài)［31-34］；2、種胚發(fā)育不全：種胚發(fā)育不完全會導(dǎo)致種子休眠，有些種胚雖已發(fā)育完全，但需完成生理后熟才能萌發(fā)［35-37］；3、萌發(fā)抑制物的存在：有些種子自身含有萌發(fā)抑制性物質(zhì)，抑制其萌發(fā)并處于休眠狀態(tài)［38-39］；4、不良環(huán)境：種子在惡劣的環(huán)境下難以萌發(fā)，處于休眠狀態(tài)［40-41］。

曹小路等［42］為確定種皮和胚乳是否是限制桃兒七種子萌發(fā)的主要因素，采用組織切片和顯微技術(shù)，對桃兒七種子及其不同萌發(fā)期的解剖結(jié)構(gòu)、以及播種后一定時期內(nèi)的植株生長形態(tài)進行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桃兒七種子由致密的種皮、多層胚乳和種胚構(gòu)成，由此可以推測種皮和胚乳的限制以及生理后熟是引起桃兒七種子休眠期長難以萌發(fā)的主要原因。李承德等［30］通過開展桃兒七種子分離胚培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)桃兒七分離胚和切除2/3胚乳的種子均在第2天開始萌發(fā)，萌發(fā)率分別為91.1%和90.0%，15 d后長成幼苗且二者長勢幾乎一致，但是剝離種皮組一直未萌發(fā)。由該結(jié)果推測，桃兒七種子多層胚乳的結(jié)構(gòu)不利于種胚代謝導(dǎo)致貯藏在胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)不能被分解和利用，種子萌發(fā)的呼吸作用和代謝的生理生化過程受到阻礙，導(dǎo)致桃兒七種子處于休眠狀態(tài)難以萌發(fā)［43-44］。因此我們可以采取酸堿處理蝕破種皮、分離胚培養(yǎng)或?qū)⑵涑墒斓姆N胚進行組織培養(yǎng)等技術(shù)手段來打破桃兒七種子的休眠從而提高萌發(fā)率。本人所在課題組經(jīng)過前期的研究也發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的H2SO4溶液處理桃兒七種子，能顯著提高萌發(fā)率。

自然情況下，種子的萌發(fā)和幼苗的生長會受到凋落覆蓋物的影響［45-46］。在植物整個生長過程萌芽階段和幼苗時期是較為脆弱的階段，此時植株無穩(wěn)定的抗逆性，難以應(yīng)對復(fù)雜多變的生長環(huán)境，且對土壤和水熱條件要求較高［47-49］，惡劣的生長環(huán)境會影響種子萌發(fā)及幼苗的生長，造成種子或植株壞死。張高翔等［50］為了探究凋落物對桃兒七種子萌發(fā)影響的生物化學(xué)原因來進一步闡明凋落物對桃兒七種子萌發(fā)與幼苗生長的影響，采用野外調(diào)查和室內(nèi)控制相結(jié)合的方法，對桃兒七凋落物浸提液進行GC-MS檢測。結(jié)果表明，凋落物提取液對桃兒七種子萌發(fā)及幼苗生長起到一定的抑制作用，種子萌發(fā)及幼苗的生長跟濃度呈正相關(guān)。因此在大規(guī)模人工種植時，尤其在萌發(fā)階段及幼苗生長時期要及時清理種子和幼株上覆蓋的凋零物，減少自毒作用對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。

李承德［30］等人用桃兒七種子浸提液浸泡小麥和黃瓜種子后觀察并記錄種子萌發(fā)和幼苗生長狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小麥和黃瓜種子經(jīng)桃兒七種子浸提液浸泡后，發(fā)芽率分別降低了10.00%和9.33%。小麥的平均高度和黃瓜平均根長分別降低了1.61 cm和0.53 cm，均低于清水對照組，由此推測桃兒七種子中含有萌發(fā)抑制性物質(zhì)，這與張高翔等［50］的研究結(jié)果一致，進一步說明桃兒七種子內(nèi)含有萌發(fā)抑制物，存在自毒作用，證明這也是導(dǎo)致桃兒七種子休眠期長，難以萌發(fā)的原因。

綜上，桃兒七種子休眠期長、萌發(fā)困難的原因總結(jié)如下：1、致密種皮導(dǎo)致的物理休眠；2、多層胚乳導(dǎo)致的機械休眠；3、生理后熟；4、萌發(fā)抑制物形成的自毒作用。后期對于高效破除桃兒七種子休眠技術(shù)方法的探索可圍繞這四個方面開展。

2 破除桃兒七種子休眠的方法

2.1 低溫層積處理打破桃兒七種子的休眠

層積（Stratification）是有效打破種子休眠的常用方法之一［52-54］。對于含有萌發(fā)抑制物質(zhì)而形成生理休眠的種子，層積法最為有效［55，71］。層積處理可以促進種胚形態(tài)發(fā)育成熟從而打破生理后熟，使萌發(fā)抑制性物質(zhì)含量下降，激素含量發(fā)生變化，提高酶活力，進而促進萌發(fā)有關(guān)基因的表達［56-57］。久西加等［58］通過低溫層積處理來解除桃兒七種子休眠，并觀測不同層積時期種子胚形態(tài)、胚率、發(fā)芽率、營養(yǎng)物質(zhì)含量、內(nèi)源激素水平和呼吸途徑關(guān)鍵限速酶的活性變化，探究低溫層積過程中桃兒七種子胚形態(tài)及生理生化變化和休眠解除之間的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果表明：在低溫層積過程中，桃兒七種子胚形態(tài)為魚雷型或子葉型，說明桃兒七種子不存在形態(tài)休眠；種子發(fā)芽率在層積后期（60～75 d）顯著提高（P＜0.05）；層積后種子內(nèi)淀粉含量及丙酮酸激酶活性、琥珀酸脫氫酶活性顯著降低（P＜0.05），其可溶性蛋白和IAA含量顯著升高（P＜0.05），萌發(fā)促進物和抑制物比例（GA/ABA、IAA/ABA、GA+IAA/ABA）呈升高趨勢，種子發(fā)芽率與可溶性蛋白呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化為種子休眠解除過程各代謝活動提供能量，其中淀粉是最主要的供能物質(zhì)；層積過程中磷酸戊糖途徑被活化、萌發(fā)促進物和抑制物比例升高，IAA含量顯著上升是桃兒七種子休眠解除的關(guān)鍵［58］。因此桃兒七種子的休眠特性不是單一因素決定而是由萌發(fā)促進物和抑制物共同調(diào)控的結(jié)果。

2.2 植物激素處理打破桃兒七種子休眠

種子休眠與萌發(fā)受到許多因素的影響，如種子發(fā)育的外在環(huán)境及內(nèi)部基因的選擇性調(diào)控表達等，其中內(nèi)源性激素發(fā)揮著重要的作用，是調(diào)節(jié)種子休眠與萌發(fā)的關(guān)鍵因子［59-60］。內(nèi)源激素與種子萌發(fā)及休眠的關(guān)系一直是種子生理生化研究的熱點。目前有很多關(guān)于種子休眠萌發(fā)和植物激素關(guān)聯(lián)性的研究，其中脫落酸和赤霉素被證明是起關(guān)鍵作用的內(nèi)源信號分子［61-62］。脫落酸有維持種子休眠狀態(tài)的作用，赤霉素可打破種子休眠從而促進萌發(fā)。乙烯作為種子發(fā)育氣體環(huán)境中的重要組成部分，與其他激素交互作用調(diào)控種子休眠與萌發(fā)［63］。油菜素內(nèi)酯可以調(diào)節(jié)植物的光合作用、呼吸作用、蒸騰作用，促進植物葉片RuBP羧化酶的活性，提高葉綠素含量增加CO2的同化能力，從而提高光合速率，解除光對生長的抑制作用［64］。在種子休眠和萌發(fā)過程中，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和大量突變體的發(fā)現(xiàn)，有關(guān)種子休眠與萌發(fā)的單個激素或各激素間相互調(diào)控作用的機理也日益明確，各激素間的相互作用組成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，表現(xiàn)出種子休眠與萌發(fā)的現(xiàn)象［34］。

2.2.1 脫落酸（Abscisic acid，ABA）對桃兒七種子休眠與萌發(fā)的調(diào)控作用

在種子萌發(fā)過程中，內(nèi)源激素起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中脫落酸作為傳統(tǒng)的五大植物激素之一，在種子發(fā)育時期可以引發(fā)并促進休眠，抑制種子過早萌發(fā)，幫助種子抵御不良環(huán)境，其作用機制主要是通過調(diào)節(jié)ABA相關(guān)的基因或功能蛋白的表達影響種子萌發(fā)［65］。早期階段發(fā)育中的種子內(nèi)ABA積累量較低，發(fā)育中期ABA累積量最大，伴隨著種子的成熟干燥而下降［66］。農(nóng)業(yè)上常使用脫落酸作為種子的萌發(fā)抑制劑，阻止種子穗發(fā)芽，有利于種子的貯藏造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活。

葉耀輝等［69］通過離體胚培養(yǎng)、生物鑒定以及GA3（Gibberellin acid ）浸種、低溫層積等方法處理桃兒七種子，并采用HPLC法對桃兒七種子破休眠過程中內(nèi)源激素吲哚乙酸、赤霉素以及脫落酸含量變化進行動態(tài)測定來研究桃兒七種子萌發(fā)特性及其在不同破除休眠處理過程中內(nèi)源激素的變化規(guī)律，為桃兒七種子的破除休眠和種質(zhì)資源貯藏奠定基礎(chǔ)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高GA/ABA值可有效促進種子萌發(fā)，GA和ABA在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中呈拮抗作用，其中ABA含量與種子萌發(fā)率呈負相關(guān)。桃兒七種子在不同破除休眠處理組間ABA含量有極顯著差異，處理組ABA含量與對照組（CK）均達到極顯著差異，隨著ABA含量的降低，種子萌發(fā)率規(guī)律性提高［67］。桃兒七種子內(nèi)ABA含量的動態(tài)變化過程基本遵循萌發(fā)率增大ABA含量減少這一規(guī)律與久西加等［58］通過等溫層積破除桃兒七種子休眠并且測到的內(nèi)源性激素活性的變化與休眠與萌發(fā)的內(nèi)在聯(lián)系的結(jié)果是一致的。

2.2.2 赤霉素（Gibberellic acid，GA3）對桃兒七種子休眠與萌發(fā)的調(diào)控作用

赤霉素是一類廣泛存在的植物激素，對植物生長有重要影響［62］。眾多研究表明赤霉素通過促進種胚發(fā)育解除種子的生理性休眠、弱化胚乳、提高α-淀粉酶的活力以及超氧化物歧化酶、過氧化物酶、等活性促進大分子物質(zhì)降解，加快降解可溶性蛋白從而增強種子活力來促進種子休眠破除提高萌發(fā)率［68］。李承德等［30］用低溫層積與GA3浸種的綜合處理開展桃兒七種子的萌發(fā)實驗，該研究表明GA3對于打破種子休眠，提高種子活力具有顯著促進作用。對桃兒七種子進行不同濃度GA3溶液處理的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度的GA3處理相較于CK組能提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢，說明在破除桃兒七種子休眠過程中不同濃度赤霉素處理具有顯著提高其萌發(fā)的效果。在后期的研究中可以探究先用化學(xué)試劑處理再結(jié)合赤霉素和低溫層積來破除桃兒七種子休眠提高其萌發(fā)率。

ABA和GA3是種子休眠獲得和解除過程中起關(guān)鍵作用的內(nèi)源信號分子，其中ABA誘導(dǎo)種胚細胞停止分裂、啟動并維持種子休眠，而GA3則啟動和促進種子萌發(fā)，兩者在調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)過程中形成拮抗作用［72］。在生理水平上：ABA和GA3合成和分解代謝之間的動態(tài)平衡是促進種子萌發(fā)和休眠平衡的關(guān)鍵，決定種子的萌發(fā)能力。在分子水平上：ABA和GA3間的拮抗作用體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄因子的相互調(diào)節(jié)［69］。低溫層積處理可以促使種子內(nèi)部激素變化、抑制物質(zhì)降解、大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)、提高一些酶的活力、促進有關(guān)基因的表達、增強種皮透性以及降低胚對脫落酸的敏感性等，再加上外源性促進生長的激素處理［70］。因此在低溫層積過程或者低溫層積處理后再使用植物激素處理種子，均比單一使用植物激素處理對于提高種子發(fā)芽率和萌發(fā)勢更加顯著，這也為后期運用植物激素處理促進桃兒七種子的萌發(fā)提供了實驗思路。

2.2.3 對苯二酚對桃兒七種子休眠與萌發(fā)的調(diào)控作用

栗孟飛等［51］為進一步深入解析桃兒七種子休眠機制，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀對桃兒七種子的乙醚浸提液進行分離與鑒定，結(jié)果表明，分離鑒定出的脂肪類、烷類、酸類等19種化合物中，多數(shù)化合物已被前人證明具有生物抑制活性，其中對苯二酚是該實驗首次從桃兒七種子浸提液中分離出的有機化合物，并利用對苯二酚浸泡小麥種子進行生物活性鑒定實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.1～1.0 mg/L的對苯二酚可顯著促進小麥的生長。在桃兒七種子分離胚培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的對苯二酚，發(fā)現(xiàn)桃兒七無菌苗的生長被顯著促進，且縮短了生長和發(fā)育周期，植株生長狀況良好。此結(jié)果證明對苯二酚在植物的生長和發(fā)育方面具有類似于植物生長激素的促進效果，同時也可以促進種子萌發(fā)［73］。對苯二酚在桃兒七種子中含量相對較低使得對苯二酚在桃兒七種子萌發(fā)及生長過程中的生物活性強度相對降低［72］，所以并未顯示出促進萌發(fā)和植株生長、發(fā)育的生物活性。目前對于對苯二酚在調(diào)控種子萌發(fā)及植物生長發(fā)育中的應(yīng)用研究在中外文獻中報道頗少，其作用機制有待進一步研究。

3 展望和思考

繁殖是植物生活史上的關(guān)鍵時期，其中種子是植物生活史中重要的組成部分，對保護植物活動和延續(xù)植物多樣性至關(guān)重要，并且種子具有體積小的特點可增加每個儲存區(qū)域儲存繁殖體的密度［74］。種子的萌發(fā)決定種子擴散，進而影響植物生長的區(qū)域和時間［76］。一般來說，除了頑拗性種子以外，絕大多數(shù)植物的種子都具有休眠特性［77］。種子休眠是植物生長發(fā)育過程中的一個暫?，F(xiàn)象，或稱為“生命的隱蔽” 現(xiàn)象，是植物經(jīng)過長期演化而獲得的一種對環(huán)境條件及季節(jié)性變化的生物學(xué)適應(yīng)性，通過這種適應(yīng)性物種得以不斷生存、發(fā)展和進化［77］，是一種原始性狀，對于植物完成整個生活史十分必要［74-75］。通過休眠特性改變繁殖體對環(huán)境因子的敏感性，從而調(diào)節(jié)幼苗的出土?xí)r間維持種群的存在和更新［78-79］。目前對于瀕危藏藥桃兒七種子休眠特性的研究迫在眉睫。其根莖主要提取物中鬼臼毒素及其衍生物對于治療乳腺癌、宮頸癌、和尖銳濕疣，均具有較顯著的臨床治療效果［17-18，20］。國內(nèi)外學(xué)者對桃兒七根莖提取物鬼臼毒素的藥理作用、新化學(xué)成分的挖掘、現(xiàn)代臨床劑型的開發(fā)，以及衍生物的不斷修飾和創(chuàng)新，為癌癥和感染人乳頭瘤病毒的患者帶來了新的希望。

在前人的研究基礎(chǔ)上可采用其他破除種子休眠處理方法擬找到一條高效破除桃兒七種子休眠的技術(shù)方法。通過使用恒溫冷層積加其他植物激素處理或根據(jù)相關(guān)文獻設(shè)置其他植物激素或化學(xué)試劑處理的單因素或多因素實驗來提高其萌發(fā)率。并基于代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)綜合解析桃兒七種子的萌發(fā)特性和休眠機制，挖掘控制桃兒七種子萌發(fā)和休眠的調(diào)控基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及各處理破除休眠過程中種子內(nèi)生理生化指標(biāo)的變化來綜合確定并解析破除休眠提高萌發(fā)的技術(shù)方法?，F(xiàn)代研究表明乙烯可以促進種子萌發(fā)［80-81］，其作用機制主要是通過降低組織對內(nèi)源ABA的敏感性來負向調(diào)節(jié) ABA的信號在種子休眠中的作用來促進種子萌發(fā)，或弱化珠孔胚乳組織來促進種子的萌發(fā)［82-83］。因此可以使用乙烯誘導(dǎo)桃兒七種子萌發(fā)，以期能縮短桃兒七種子的休眠期，更加顯著的提高其萌發(fā)率，為桃兒七的大規(guī)模仿生態(tài)種植提供大量種苗。

油菜素甾醇（Brassinosteroids，BR）是一類在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮多種作用的類固醇激素［84-86］，BRs家族中最活躍的成分是油菜素內(nèi)酯，它能夠激活BR信號，與其他植物激素一起調(diào)控植物的生長發(fā)育［87］。用油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)桃兒七種子的萌發(fā)，探索油菜素內(nèi)酯在桃兒七種子休眠破除誘導(dǎo)萌發(fā)過程中的作用機制，并將植物激素、化學(xué)試劑以及物理方法綜合處理誘導(dǎo)萌發(fā)的實驗過程中觀察桃兒七種子胚形態(tài)、內(nèi)源激素、營養(yǎng)物質(zhì)及呼吸和代謝過程中關(guān)鍵酶活性的動態(tài)變化來明晰桃兒七種子萌發(fā)特性和休眠機制。

本人所在研究組前期已開展了大量桃兒七的相關(guān)研究工作，奠定了扎實的研究基礎(chǔ)，本人在此基礎(chǔ)上分別從低溫層積、植物激素和化學(xué)試劑處理的角度出發(fā)開展桃兒七種子破除休眠與促進萌發(fā)的研究工作，目前取得的一些實驗結(jié)果與本綜述引用的文獻結(jié)果是一致的。另外從內(nèi)源激素含量變化、營養(yǎng)物質(zhì)代謝及種子萌發(fā)過程中呼吸代謝關(guān)鍵酶活性和休眠調(diào)控關(guān)鍵基因等角度出發(fā)，擬聯(lián)合代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)方法探究并解析桃兒七種子休眠及萌發(fā)機制，總結(jié)出一條高效破除桃兒七種子休眠、顯著提高萌發(fā)率的技術(shù)方法，希望此技術(shù)方法為桃兒七規(guī)?；斯し律鷳B(tài)種植提供技術(shù)指導(dǎo)，更為野生桃兒七資源的保護、鬼臼毒素化合物的生產(chǎn)、綜合開發(fā)利用奠定可行的技術(shù)方案和扎實的理論依據(jù)。