大果白刺種子內(nèi)源激素含量研究

任尚福

（1.喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 喀什 844000）

荒漠地區(qū)植物種類非常貧乏，該地區(qū)的建群植物和優(yōu)勢(shì)植物大都屬于第三紀(jì)孑遺植物，其中包含大果白刺（Nitraria roborowskiiKom.）［1］。大果白刺是由Komapov在1908年命名的，其模式標(biāo)本產(chǎn)地為新疆且末［2］。在自然狀態(tài)下，大果白刺種子具有強(qiáng)烈的休眠現(xiàn)象，因此生產(chǎn)實(shí)踐中探究大果白刺種子休眠的原因具有重要意義。內(nèi)源激素學(xué)說認(rèn)為休眠取決于萌發(fā)抑制物與促進(jìn)物的綜合作用，而并非單獨(dú)取決于某種內(nèi)源激素的含量高低。Khan在內(nèi)源激素學(xué)說基礎(chǔ)上提出了調(diào)控種子萌發(fā)與休眠的“三因子學(xué)說”［3］，即赤霉素（Gibberellin， GA3）、細(xì)胞分裂素（Cytokinin， CTK）和萌發(fā)抑制物（如Abscisic acid， ABA）是與種子萌發(fā)和休眠緊密相關(guān)的首要因子，其中任何一種激素缺失，均可致使種子萌發(fā)或者停留在休眠階段。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，赤霉素、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、乙烯、油菜素內(nèi)酯以及其它一些信號(hào)分子，均對(duì)植物種子休眠和萌發(fā)的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［4-5］。在調(diào)控種子休眠和破除休眠過程中，種子內(nèi)脫落酸和赤霉素的含量平衡發(fā)揮著主導(dǎo)作用［6］，即休眠種子開始萌發(fā)的調(diào)節(jié)因子并非GA3和ABA的絕對(duì)含量，而是二者間的比值平衡（ABA / GA3）［7］。Wang 通過對(duì)GA3、ABA、ZR、IAA含量及其比值的測(cè)定提出，內(nèi)源激素間的相互作用極大的影響和調(diào)控山桐子種子的萌發(fā)［8］。本研究通過測(cè)定低溫層積前后大果白刺種子赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、生長(zhǎng)素（IAA）、細(xì)胞分裂素（ZR）和乙烯（ETH）等內(nèi)源激素含量的變化，探討大果白刺種子的內(nèi)源激素含量變化與其種子休眠和萌發(fā)之間的調(diào)控關(guān)系，既可為大果白刺種子破除休眠提供技術(shù)支撐，也可為進(jìn)一步研究其種子休眠機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為大果白刺種子，購(gòu)置于民勤縣麟權(quán)生態(tài)種業(yè)有限公司種植基地。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與研究方法

2.1 種子萌動(dòng)處理

大果白刺種子與河沙按照質(zhì)量1：3的比例混合，其中河沙含水量約75%，放置室外沙藏層積處理90 d。由于河沙具有透水、透氣、比熱容小的特點(diǎn)，因此本研究采用河沙作為層積基質(zhì)，種子在后熟階段經(jīng)外界晝夜變溫反復(fù)刺激，其種胚內(nèi)部進(jìn)行著復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，加快了破除休眠的進(jìn)程［9］。

2.2 內(nèi)源激素含量測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定低溫層積前后大果白刺種子內(nèi)源激素含量的變化，測(cè)定的主要植物激素包括：GA3、ABA、IAA、ZR和ETH，每種處理3次重復(fù)。分別計(jì)算GA3/ ABA、IAA / ABA和ZR / ABA的比值。

2.2.1 赤霉素等激素提取測(cè)量方法

2.2.1 .1 樣品提取純化

精確稱取研碎后冷凍的大果白刺種子0.2 g，加入2 mL預(yù)冷的80%甲醇，勻漿，保鮮膜密封后于4℃冷浸過夜，然后在4℃條件下5 000 r/min離心10 min，取上清液，殘?jiān)^續(xù)用80%甲醇萃取，振蕩，超聲2次，合并上清液，在4℃條件下用氮?dú)鈱⒂袡C(jī)相吹干，剩下水相。加入2 mL石油醚脫色3次，水相用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，在4℃條件下用氮?dú)獯蹈桑尤雙H=3.5的乙酸溶液，過C18小柱凈化，用甲醇洗脫，收集洗脫液在4℃條件下減壓至干，用流動(dòng)相溶解定容，過0.22 μL濾膜，待測(cè)。

2.2.1 .2 測(cè)試條件

檢測(cè)器：VWD；色譜柱：C18（250 mm × 4.6 mm；5 μL）；進(jìn)樣量：10 μL；波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL /min；流動(dòng)相：甲醇：乙酸水溶液（pH=3.6）為20：80。

2.2.2 乙烯提取測(cè)量方法

2.2.2 .1 樣品提取純化

精確稱取研碎后冷凍的大果白刺種子0.2 g，放入1 mL棕色進(jìn)樣瓶中，滴加1滴蒸餾水，擰緊瓶蓋密封，室溫放置24 h，然后上機(jī)待測(cè)。

2.2.2 .2 測(cè)試條件

色譜柱：HP-5 （30 mm × 0.25 mm）；檢測(cè)器：FID；進(jìn)樣量：5 μL；后檢測(cè)器溫度：230℃。

2.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0對(duì)大果白刺種子內(nèi)源激素等進(jìn)行單因素方差分析，Duncan′s法檢驗(yàn)其差異顯著性，利用Excel制作圖表，統(tǒng)計(jì)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SE）表示。用Pearson相關(guān)分析揭示激素水平間的相關(guān)關(guān)系。所有圖形處理均采用Graphpad Prism 5.0完成。

3 結(jié)果與分析

3.1 GA3含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-A所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子GA3含量大幅度增加，由對(duì)照組的1.178 μg/g升高至低溫層積后的1.875 μg/g，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：大果白刺經(jīng)過低溫層積后，GA3含量增加，并且根據(jù)原有實(shí)驗(yàn)，低溫層積可促進(jìn)大果白刺種子萌發(fā)率升高，從而證明GA3含量增加有利于促進(jìn)大果白刺種子的休眠破除和萌發(fā)。

3.2 ABA含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-B所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子ABA含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，由對(duì)照組的0.196 μg/g下降至實(shí)驗(yàn)組的0.125 μg/g，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)證明ABA含量下降有利于大果白刺種子休眠的破除。

3.3 IAA含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-C所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子IAA含量呈明顯下降趨勢(shì)，由對(duì)照組的0.293 μg/g下降至實(shí)驗(yàn)組的0.231 μg/g，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

3.4 ZR含量變化

ZR能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂并調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，在高等植物中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞分裂素大多是玉米素核苷［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-D所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子ZR含量呈明顯下降趨勢(shì)，由對(duì)照組的0.084 μg/g下降至實(shí)驗(yàn)組的0.067 μg/g，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

3.5 ETH含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-E所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子ETH含量呈明顯下降趨勢(shì)，由對(duì)照組的1.005 μg/g下降至實(shí)驗(yàn)組的0.867 μg/g，與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 大果白刺種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的變化Fig.1 Changes of endogenous hormone contents during seeds germination seeds of N roborowskii

3.6 內(nèi)源激素含量比

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，大果白刺種子的GA3/ABA值呈顯著提升（圖2-A），其對(duì)照組（8.52 μg/g）與實(shí)驗(yàn)組（11.96 μg/g）相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。IAA/ABA值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2-B），其對(duì)照組（2.12 μg/g）與實(shí)驗(yàn)組（1.88 μg/g）相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。ZR/ABA值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖2-C），其對(duì)照組（0.62 μg/g）與實(shí)驗(yàn)組（0.55 μg/g）相比呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 大果白刺種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量比值的變化Fig.2 Changes of endogenous hormone content ratio during seeds germination of N roborowskii

4 討論

大量證據(jù)表明，種子休眠解除和萌發(fā)過程中，各種內(nèi)源激素經(jīng)歷了一系列變化，即種子通過內(nèi)源激素調(diào)節(jié)控制其休眠［11］。不同的植物激素通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑，對(duì)植物特定生理活動(dòng)產(chǎn)生不同的影響，并最終實(shí)現(xiàn)調(diào)控種子的休眠進(jìn)程。

4.1 種子休眠前后不同植物激素含量變化

GA3可以促進(jìn)許多種子萌發(fā)［6，12-13］，在高等植物中普遍存在。實(shí)驗(yàn)證明大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，GA3含量顯著升高，GA3含量在種子層積末期均高于層積初期，有利于種子的萌發(fā)，這與前人研究結(jié)果一致［14］。研究證明GA3在植物體內(nèi)含量逐漸發(fā)生變化，自然條件下，植物結(jié)束休眠時(shí)和開始萌發(fā)時(shí)，體內(nèi)GA3均能增加［15］。對(duì)榛種子低溫處理時(shí)，證明冷凍之后GA3生成是完成種子萌發(fā)所必須依賴的過程［16］。植物種子的生理休眠解除，伴隨著GA3的敏感性增加，而強(qiáng)迫休眠的解除與GA3重新合成和GA3誘導(dǎo)水解酶合成有關(guān)，這些酶水解貯藏的碳水化合物，細(xì)胞壁水解減少胚乳層的阻力，使胚根能突破種皮萌發(fā)［17］。

ABA一般被認(rèn)為是天然的萌發(fā)抑制劑，具有阻礙萌發(fā)、維持休眠的作用，能抑制核酸正常代謝，干擾RNA的合成，從而阻礙蛋白質(zhì)和水解相關(guān)酶類的合成［18］。實(shí)驗(yàn)證明大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，其種子ABA含量不斷降低。研究證明母體來源的ABA（由種皮和果實(shí)合成）能抑制發(fā)育初期的早熟萌發(fā)［18］，可控制胚的生長(zhǎng)和防止植物發(fā)生“胎萌”［19］。種子內(nèi)源激素的主導(dǎo)作用由ABA向GA3的轉(zhuǎn)化是種子破除休眠的關(guān)鍵，這與許世泉等對(duì)東北鐵線蓮種胚后熟過程中的內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化是一致的［20］。

實(shí)驗(yàn)證明大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，其種子IAA含量呈現(xiàn)顯著性降低。韃靼槭種子的游離IAA含量在層積期間逐漸降低，這種降低與胚休眠的解除呈正相關(guān)［3］。層積后期IAA含量的下降，可能是隨著種胚細(xì)胞分裂的不斷增加而引起的IAA含量不斷降低［12］，這些與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論是一致的。IAA與種子休眠的關(guān)系存在著不同的研究結(jié)論：有研究認(rèn)為，IAA與種子的休眠解除無關(guān)或IAA含量與種子休眠解除的關(guān)系不大［21］；但也有研究認(rèn)為，IAA對(duì)種子休眠的解除以及在適溫下種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用［22-23］，例如實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)過低溫沙藏的北沙參種子IAA的含量明顯增高，相應(yīng)的種子萌發(fā)率也升高［24］。

玉米素核苷（ZR）是細(xì)胞分裂素中活性強(qiáng)且易測(cè)定的激素儲(chǔ)存形式，是植物生長(zhǎng)與發(fā)育生理過程的活躍參與者［25］，植物體內(nèi)常見的游離態(tài)的ZR主要分布在莖尖、根尖和萌發(fā)的種子中［26］，具有抵消發(fā)芽抑制物質(zhì)的作用，調(diào)控種子發(fā)育中的物質(zhì)和能量代謝［27］。實(shí)驗(yàn)證明大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，ZR含量有不同程度的降低，ZR對(duì)種子萌發(fā)抑制物具有拮抗作用，在一定程度上與種子休眠呈負(fù)相關(guān)性，已經(jīng)有學(xué)者證明這一結(jié)論［28］。

乙烯（ETH）作為植物的一種天然代謝產(chǎn)物，調(diào)控許多植物的生理發(fā)育過程，在植物抗逆過程中發(fā)揮著重要作用［6］。實(shí)驗(yàn)證明大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，ETH含量也有一定程度的降低，已有研究證明ETH能夠解除ABA和其它抑制物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用［29］，說明ETH含量降低可以促進(jìn)種子萌發(fā)，與本研究結(jié)論基本一致。

4.2 內(nèi)源激素含量比

研究證明不同激素間的相互作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單個(gè)激素的獨(dú)立作用，種子萌發(fā)與其內(nèi)源激素含量的變化密切相關(guān)，各種激素能夠啟動(dòng)種子內(nèi)貯藏物質(zhì)的分解及合成并最終啟動(dòng)種子的萌發(fā)［30］。相對(duì)于單一內(nèi)源激素，不同激素間的平衡變化對(duì)種子休眠和萌發(fā)具有更重要的意義，尤其是促進(jìn)與抑制生長(zhǎng)激素之間的比例［31］。

研究顯示，種子休眠解除、開始萌發(fā)的調(diào)節(jié)因子并非GA3和ABA的絕對(duì)含量，而是二者之間的比值［7］。實(shí)驗(yàn)研究證明，大果白刺種子GA3/ABA值顯著提升，相關(guān)學(xué)者研究黃瑞香種子GA3/ABA影響其種子休眠進(jìn)程［12］，其結(jié)論與本研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中大果白刺經(jīng)過低溫層積處理后，種子內(nèi)生長(zhǎng)激素促進(jìn)物的含量增加，生長(zhǎng)激素抑制物的含量降低，種子萌發(fā)過程受外界環(huán)境信號(hào)的刺激后，引起內(nèi)部激素含量和比例的改變，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的生理調(diào)控萌發(fā)進(jìn)程［23］。

通過統(tǒng)計(jì)分析各種激素間的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)大果白刺種子的抑制物和促進(jìn)物之間，即IAA/ABA和ZR/ABA值與沒有進(jìn)行低溫層積的種子相比，其比值顯著降低，說明種子抑制型激素占優(yōu)勢(shì)，其萌發(fā)過程相關(guān)代謝活動(dòng)受阻［23］。ZR/ABA值波動(dòng)幅度與IAA/ABA相比較小，說明ZR對(duì)種子萌發(fā)影響較小。植物激素調(diào)控大果白刺種子萌發(fā)是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，各種激素之間的平衡關(guān)系對(duì)種子萌發(fā)的調(diào)控具有重要作用。

5 結(jié)論

大果白刺種子經(jīng)過4℃低溫層積90 d之后，其種子GA3含量顯著升高，而ABA、IAA、ZR和ETH含量均呈現(xiàn)顯著下降。在各種內(nèi)源激素含量比值中，GA3/ABA值呈顯著提升，IAA/ABA和ZR/ABA值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)證明較高的GA3含量和GA3/ABA值以及較低的ABA、IAA、ZR、ETH含量和IAA/ABA、ZR/ABA值，對(duì)大果白刺種子破除休眠和促進(jìn)萌發(fā)具有一定的積極作用。