主要農(nóng)作物種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

張海波 陳 西 楊娟妮 劉 冰 張 田 周 波 陳國瑛 張 英

（陜西省種子工作總站，西安 710018）

農(nóng)作物種子的選育，分為自然留種、遺傳育種和分子育種等幾個階段，目前農(nóng)作物種子主要通過遺傳育種的方式選育。轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為新型分子育種技術(shù)，為農(nóng)作物的遺傳改良提供了廣闊的前景[1-2]。全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植面積，在2019 年已經(jīng)達(dá)到了1.904 億hm2，1996-2019 年轉(zhuǎn)基因作物的累計(jì)種植面積已經(jīng)達(dá)到27 億hm2[3]。

我國農(nóng)作物種子市場巨大，為使種子質(zhì)量逐年提高，種子監(jiān)管必不可少。農(nóng)作物種子的監(jiān)管包括實(shí)驗(yàn)室研究、品種審定、企業(yè)加工、市場營銷、種植和進(jìn)出口等環(huán)節(jié)，通過這些環(huán)節(jié)的監(jiān)管，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因檢測樣品非常多。為了提高檢測效率、降低檢測成本，急需科學(xué)高效的轉(zhuǎn)基因篩查檢測方法，為轉(zhuǎn)基因成分的政府監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。

目前轉(zhuǎn)基因成分分子檢測方法有蛋白質(zhì)檢測和核酸檢測兩大類。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測根據(jù)其特異性的不同可以分成3 類，包括篩查檢測法（Screening PCR）、基因特異性檢測法（Gene-specific PCR）和轉(zhuǎn)化體特異性檢測法（Event-specific PCR）[4]。篩查法是針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中通用元件的檢測，包括啟動子、終止子或標(biāo)記基因等元件，如CaMV 35S啟動子、NOS終止子等。該方法的原理是，首先統(tǒng)計(jì)分析已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物的轉(zhuǎn)化體外源基因和元件插入序列情況[4]，其次是選擇使用頻率高并且可以覆蓋全部已知轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的最少數(shù)外源元件作為檢測對象。有其中的任何一個元件檢出為陽性，則表明該樣品中可能含有轉(zhuǎn)基因成分。若檢測的每個元件的結(jié)果都為陰性，則說明該樣品中未檢出已知商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物的成分[4]。不同農(nóng)作物的商業(yè)化轉(zhuǎn)化體不同，其所用基因元件的種類和頻次也不同，每個作物需根據(jù)具體轉(zhuǎn)化體的情況，采取不同的篩查策略進(jìn)行篩查檢測[5]。本文以我國五大主要農(nóng)作物玉米、水稻、小麥、大豆和棉花為研究對象，對主要農(nóng)作物的轉(zhuǎn)基因篩查方法進(jìn)行了分析研究。

1 玉米種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

1.1 玉米的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)推廣情況玉米屬于禾本科玉米屬，起源于中南美洲熱帶和亞熱帶高原地區(qū)，在我國已有400 多年的種植歷史。玉米的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體有27 個，主要分抗蟲和耐除草劑兩種類型。我國目前頒發(fā)了部分轉(zhuǎn)基因玉米的安全證書，但是未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化種植。進(jìn)口的國外轉(zhuǎn)基因玉米也只能用作加工原料。截至2021 年底，獲準(zhǔn)作為加工原料進(jìn)口到中國的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體有15 個，分別是1 個耐旱玉米MON87460，1 個品種改良玉米Event 3272，3 個耐除草劑玉米GA21、T25、NK603，6 個抗蟲耐除草劑玉米TC1507、Bt11、Bt176、MON88017、59122、Bt11×GA21，4 個抗 蟲 玉米MIR604、MON89034、MIR162、MON810[6-7]。轉(zhuǎn)基因玉米的研究方向有抗蟲、耐除草劑、營養(yǎng)高效、高產(chǎn)等優(yōu)良性狀的研究。

1.2 玉米的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體分析玉米有27 個轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體，多樣的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體增加了對玉米中轉(zhuǎn)基因成分篩查的難度。根據(jù)轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)庫（GMDD，http：//gmdd.shgmo.org/，下同）[6]、歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南（http：//www.gmo-compass.org/eng/gmo/db，下同）[7]和美國環(huán)境風(fēng)險評估中心轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫（CERA，http：//www.cera-gmc.org/，下同）[8]，以轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化的轉(zhuǎn)化體作為行，以基因元件作為列，構(gòu)建玉米轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣（表1）。在表1 中的27 個玉米轉(zhuǎn)化體中，出現(xiàn)頻次最高的元件是CaMV 35S啟動子，出現(xiàn)23次；其次是NOS終止子，17 次；之后是Bar基因和CP4-EPSPS基因，各7 次；pat基因出現(xiàn)5 次；FMV 35S啟動子1 次[9]。

表1 玉米轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣

1.3 玉米的轉(zhuǎn)基因篩查策略在表1 的27 個玉米轉(zhuǎn)化體中，有23 個轉(zhuǎn)化體含有CaMV 35S啟動子。不含有CaMV35S啟動子的4 個轉(zhuǎn)化體中都含有NOS終止子。這說明，同時進(jìn)行CaMV 35S啟動子和NOS終止子檢測，可以覆蓋所有的27 個玉米轉(zhuǎn)化體。用這兩個元件對27 個轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分類，同時含有CaMV 35S啟動子和NOS終止子的轉(zhuǎn)化體有13 個，只含有CaMV 35S啟動子的轉(zhuǎn)化體有10 個，只含有NOS終止子的轉(zhuǎn)化體有4 個。因此，聯(lián)合使用CaMV 35S啟動子和NOS終止子，可實(shí)現(xiàn)對玉米種子轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測。

1.4 玉米的轉(zhuǎn)基因成分檢測路線圖在對大量玉米樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時，首先聯(lián)合使用CaMV 35S啟動子和NOS終止子進(jìn)行篩查，然后根據(jù)篩查結(jié)果，按照圖1 進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的進(jìn)一步分析和確定。圖1 中鏤空箭頭表示篩選的路線，實(shí)線箭頭表示對應(yīng)的篩選元件檢出，虛線箭頭表示對應(yīng)的篩選元件未檢出。如果CaMV 35S啟動子和NOS終止子的檢測結(jié)果都為陰性，則認(rèn)為樣品中未檢出轉(zhuǎn)基因成分。如果CaMV 35S啟動子和NOS終止子的檢測結(jié)果任何一個為陽性，則認(rèn)為樣品中檢出轉(zhuǎn)基因成分。對于篩查出陽性的樣品，需要繼續(xù)進(jìn)行其他元件的篩查，如Bar基因、CP4-EPSPS基因、pat基因、FMV 35S啟動子，或者直接使用轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法進(jìn)行確認(rèn)。

圖1 玉米轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體篩查路線

2 大豆種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

2.1 大豆的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)推廣情況大豆是豆科大豆屬一年生草本植物，在我國已有5000 多年的種植歷史，目前全國分為5 個大豆主產(chǎn)區(qū)。轉(zhuǎn)基因大豆主要種植在美國、阿根廷、巴西等美洲國家，以耐除草劑大豆為主[3]。我國目前批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因大豆的安全證書，但是沒有批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植。進(jìn)口的國外轉(zhuǎn)基因大豆只能用作加工原料。截至2022 年底，中國批準(zhǔn)的可以作為加工原料進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體共11 個，分別為1 個抗蟲耐除草劑大豆MON87701×MON89788，6 個耐除草劑大豆GTS40-3-2、A2704-12、CV127、A5547-127、MON87708、MON89788，1 個抗蟲大豆MON87701，2 個品質(zhì)改良大豆MON87769、305423 和1 個品質(zhì)改良耐除草劑大豆305423×GTS40-3-2[6-7]。轉(zhuǎn)基因大豆的主要研發(fā)方向?yàn)槟统輨?、抗蟲、抗病、品質(zhì)改良等優(yōu)良性狀的研究。

2.2 大豆轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的分析根據(jù)劉冰等[10]檢索轉(zhuǎn)基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建的大豆轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣（表2）可以看出，表中列出的15個大豆商業(yè)化轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體中，pat基因出現(xiàn)的頻次最高，共計(jì)7 次；花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子出現(xiàn)了6 次；然后是CP4-EPSPS基因、Bt基因、NOS終止子和FMV 35S啟動子，分別是4 次、3 次、2 次和2 次。

2.3 大豆的轉(zhuǎn)基因篩查策略大豆商業(yè)化轉(zhuǎn)化體中，pat基因、花椰菜花葉病毒的CaMV 35S啟動子、CP4-EPSPS基因、Bt抗蟲基因4 個靶標(biāo)元件組合使用，可以實(shí)現(xiàn)對表2 中的已知12 個大豆轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)基因篩查檢測。其他3 個轉(zhuǎn)化體DP-305423、DP356043 和BPS-CV127-9，可使用專門的轉(zhuǎn)化體特異性檢測方法進(jìn)行單獨(dú)檢測。

表2 大豆轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣[10]

2.4 大豆的轉(zhuǎn)基因成分檢測路線圖在對大量大豆樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉(zhuǎn)化體特異性檢測的順序進(jìn)行篩查，如圖2 所示。如果CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉(zhuǎn)化體特異性檢測結(jié)果都為陰性，則認(rèn)為樣品中未檢出轉(zhuǎn)基因成分。如果CaMV 35S啟動子、pat基因、CP4-EPSPS基因、Bt基因和轉(zhuǎn)化體特異性檢測結(jié)果任何一個為陽性，則認(rèn)為樣品中檢出轉(zhuǎn)基因成分[10]。

3 水稻種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

3.1 水稻的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)推廣情況水稻是禾本科稻屬一年生栽培作物，在我國有悠久的種植歷史，主要種類有秈稻和粳稻兩種。美國最早在2009年批準(zhǔn)耐除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化種植。我國在2009 年批準(zhǔn)了2 種抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)應(yīng)用安全證書，但目前并沒有商業(yè)化種植。轉(zhuǎn)cry1Ab、cry1Ac抗蟲基因水稻華恢1 號及其Bt 汕優(yōu)63 雜交種，是抗鱗翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因水稻品系，外源基因表達(dá)產(chǎn)物可以控制二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲，減少殺蟲劑的使用。富含β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)基因黃金大米是一種品質(zhì)改良水稻，β-胡蘿卜素可在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，補(bǔ)充體內(nèi)缺乏的維生素A，從而減少貧困地區(qū)兒童夜盲癥和失明的發(fā)病率。目前轉(zhuǎn)基因水稻的研究方向是抗病、抗蟲、耐除草劑等的研究。

3.2 水稻轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體分析和篩查策略目前已知的水稻轉(zhuǎn)化體包括轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因抗蟲水稻華恢1 號、Bt 汕優(yōu)63，轉(zhuǎn)pat基因耐除草劑水稻LLRICE601、LLRICE06，代謝途徑調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因黃金大米轉(zhuǎn)入的基因包括psy基因、SSUcrtI基因和hpt基因。根據(jù)轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)庫[6]、歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南[7]和美國環(huán)境風(fēng)險評估中心轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫[8]，抗蟲水稻Bt 汕優(yōu)63 和除草劑水稻LLRICE601、LLRICE06 都使用了CaMV 35S啟動子，而抗蟲水稻華恢1 號和Bt 汕優(yōu)63、耐除草劑水稻LLRICE601、轉(zhuǎn)基因黃金大米都使用了NOS終止子。由此看出，合并使用花椰菜花葉病毒CaMV 35S啟動子和NOS終止子，可實(shí)現(xiàn)對水稻中已知的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行篩查檢測。為了防止研發(fā)階段或未公開的水稻轉(zhuǎn)化體非法擴(kuò)散，可對水稻種子同時聯(lián)合cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因進(jìn)行篩查。

3.3 水稻轉(zhuǎn)基因成分檢測路線圖在對大量水稻樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因進(jìn)行篩查，然后根據(jù)篩查結(jié)果，按照圖3 進(jìn)行轉(zhuǎn)化體的進(jìn)一步分析和確定。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因和pat基因等元件的檢測結(jié)果都為陰性，則表明樣品中未檢出已知的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體。如果CaMV 35S啟動子、cry1Ab/cry1Ac基因、NOS終止子和pat基因等元件的檢測結(jié)果任何一個為陽性，則認(rèn)為樣品中檢出轉(zhuǎn)基因成分。

圖3 水稻轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體篩查路線

如果檢出CaMV 35S啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因，可能含有華恢1 號轉(zhuǎn)化體；檢出NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因，則可能含有Bt 汕優(yōu)63 轉(zhuǎn)化體；檢出CaMV 35S啟動子、NOS終止子、pat基因，可能含有LLRICE601轉(zhuǎn)化體；檢出CaMV 35S啟動子、pat基因，可能含有LLRICE06 轉(zhuǎn)化體；只檢出NOS終止子，可能含有黃金大米轉(zhuǎn)化體；檢出CaMV 35S 啟動子、NOS終止子、cry1Ab/cry1Ac基因、pat基因中任一個，而未檢出上述轉(zhuǎn)化體，則可能含有研發(fā)階段或未公開的水稻轉(zhuǎn)化體。

4 棉花種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

4.1 棉花的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)推廣情況棉花為錦葵科棉屬一年生雙子葉植物。全球轉(zhuǎn)基因棉花的種植面積僅次于大豆和玉米，位列第三，主要種植在美國、阿根廷、巴西等國。我國2015 年轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種植面積為333.3 萬hm2（5000 萬畝），占全國棉田面積的93%，其中國產(chǎn)抗蟲棉占95%以上。我國仍是全球最大的棉花進(jìn)口國，截至2022 年底，獲準(zhǔn)作為加工原料進(jìn)口到中國的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體有11 個，分別為5 個抗蟲棉花15985、COT102、531、DAS-24236-5 和DAS-21023-5，4 個抗除草劑棉花LLCotton25、GHB614、MON88913 和1445，2 個 抗蟲耐除草劑棉花GHB119 和T304-40。目前轉(zhuǎn)基因棉花的研究方向是抗病蟲、抗旱、耐除草劑、耐鹽堿和品質(zhì)改良等優(yōu)良性狀的研究。

4.2 棉花的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體分析根據(jù)轉(zhuǎn)基因檢測數(shù)據(jù)庫[6]、歐洲轉(zhuǎn)基因生物指南[7]和美國環(huán)境風(fēng)險評估中心轉(zhuǎn)基因作物數(shù)據(jù)庫[8]，以轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體為行，以常用基因元件為列，形成轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣（表3）。在表3 中的13 個棉花轉(zhuǎn)化體中，出現(xiàn)頻次最高的元件是CaMV 35S啟動子，出現(xiàn)10 次；其次是NOS終止子，出現(xiàn)9 次；之后是Bt基因6 次；Bar基因和CP4-EPSPS基因3 次；FMV 35S啟動子2 次。

4.3 棉花的轉(zhuǎn)基因篩查策略在表3 的13 個棉花轉(zhuǎn)化體中，有10 個轉(zhuǎn)化體含有CaMV 35S啟動子。不含有CaMV35S啟動子的3 個轉(zhuǎn)化體中有2個含有NOS終止子（COT102和COT67B），1 個含有CP4-EPSPS基因（GHB614）。這說明，同時進(jìn)行CaMV 35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS基因檢測，可以覆蓋所有的13 個棉花轉(zhuǎn)化體。

表3 棉花轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體信息和分子特征矩陣

由于我國批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因安全評價證書中棉花作物都是轉(zhuǎn)cry1Ab/cry1Ac基因或轉(zhuǎn)cry1Ac基因抗蟲棉，因此，使用Bt基因可實(shí)現(xiàn)對國內(nèi)棉花的高效率篩查?？紤]到以上兩點(diǎn)，同時進(jìn)行CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測，可以覆蓋國內(nèi)外所有的棉花轉(zhuǎn)化體。

4.4 棉花的轉(zhuǎn)基因成分檢測路線圖在對大量棉花樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測時，按照CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因的順序進(jìn)行篩查，如圖4 所示。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測結(jié)果都為陰性，則認(rèn)為樣品中未檢出轉(zhuǎn)基因成分。如果CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bt基因檢測結(jié)果任何一個為陽性，則認(rèn)為樣品中檢出轉(zhuǎn)基因成分。

圖4 棉花轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體篩查路線

5 小麥種子中轉(zhuǎn)基因成分篩查策略

5.1 小麥的轉(zhuǎn)基因作物研發(fā)推廣情況小麥?zhǔn)呛瘫究茊巫尤~植物，起源于亞洲西部。美國2004 年批準(zhǔn)了耐除草劑轉(zhuǎn)基因小麥MON71800 的商業(yè)化種植[6]，但截至目前種植面積很小。我國的轉(zhuǎn)基因小麥處于研發(fā)階段，目前沒有批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因小麥的安全評價證書。目前轉(zhuǎn)基因小麥的研究方向是抗病、抗旱、耐除草劑和氮高效利用等優(yōu)良性狀的研究。

5.2 小麥的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體分析和篩查策略小麥?zhǔn)俏覈狈降闹骷Z，我國目前沒有批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因小麥的安全證書和商業(yè)化種植。針對小麥轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管，其重點(diǎn)一是防止實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)研究的轉(zhuǎn)基因小麥違規(guī)擴(kuò)散，二是防止進(jìn)口小麥中混雜的轉(zhuǎn)基因小麥。轉(zhuǎn)基因耐除草劑小麥MON71800 轉(zhuǎn)入的基因有CaMV 35S啟動子、NOS終止子和CP4-EPSPS基因，而Bar基因也是耐除草劑小麥研發(fā)中經(jīng)常使用的基因元件。因此，聯(lián)合使用CaMV 35S啟動子、NOS終止子、CP4-EPSPS基因和Bar基因，可實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因小麥種子的篩查。

6 總結(jié)

我國轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展方針為大膽研究，慎重推廣，目前只批準(zhǔn)了棉花和木瓜的商業(yè)化種植。我國將按照非食用、間接食用、食用的路線圖推進(jìn)轉(zhuǎn)基因作物的產(chǎn)業(yè)化。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化在我國將成為趨勢。

隨著我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的逐步發(fā)展以及消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因食品的持續(xù)關(guān)注，農(nóng)作物種子的監(jiān)管將有效遏制違規(guī)轉(zhuǎn)基因進(jìn)入消費(fèi)市場。因此，建立快速、準(zhǔn)確、低成本的轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測方法，能夠?yàn)槲覈D(zhuǎn)基因監(jiān)管提供有力的技術(shù)支撐。本研究針對我國主要農(nóng)作物種子的轉(zhuǎn)基因成分檢測，提出了快速、準(zhǔn)確和低成本的篩查方法，可實(shí)現(xiàn)對5 種主要農(nóng)作物種子的大量樣品進(jìn)行低成本、高效率的轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測。