鼻咽癌患者血漿EBV DNA和VCA—IgA聯(lián)合檢測(cè)及臨床意義

摘要：目的 探討血漿EBV DNA 和VCA-IgA聯(lián)合檢測(cè)在監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的臨床價(jià)值。方法 分別采用熒光定量PCR法和常規(guī)免疫酶法檢測(cè)放療前后各組鼻咽癌患者血漿EBV DNA含量與血漿VCA-IgA滴度，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果 放療前組（初診）患者血漿EBV DNA和VCA-IgA陽(yáng)性率顯著高于放療后緩解組（P<0.01），與復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組與放療后緩解組比較有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論 血漿EBV DNA和VCA-IgA的聯(lián)合檢測(cè)是監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)記物。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；EB病毒DNA；EB病毒殼抗原IgA

Clinical Significance of Plasma EBV DNA and VCA-IgA for Nasopharyngeal Carcinoma

SUN Qi ， DENG Zhan-feng， SHI Shun-chang， SUN Jian-guang

（Affilicated Hospital of Shaoyang Medical College， Shaoyang 422000，Hunan，China）

Abstract：Objective To evaluate the clinical significance of quantitative analysis of EBV DNA and VCA-IgA in plasma of nasopharyngeal carcinoma patients after curative radiotherapy. Methods Using the method of PCR to test plasma EBV DNA and the method of immunoenzyme to test VCA-IgA. Results The positive rates of XRT Preoperative radiotherapy groups was significantly higher than clinical remission groups （P<0.01）， and there is no statistical significance between clinical remission and recurrent groups（P>0.05）. However， There were significant difference in recurrent or metastasis groups and clinical remission（P<0.01） . Conclusion The detection of Plasma EBV DNA and VCA-IgA is useful for surveillance of nasopharynged carcinoma patients following radiotherapy. The simultaneous combination tests can rise advantage to each other.

Key words：Nasopharyngeal Carcinoma；EBV DNA ； VCA-IgA

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其病因是多方面的，現(xiàn)已證實(shí)EB病毒（Epstein Barr Virus，EBV）與鼻咽癌密切相關(guān)。在鼻咽癌的發(fā)展過(guò)程中，EBV感染和多體細(xì)胞遺傳和表觀遺傳變化協(xié)同地破壞正常細(xì)胞的功能，引起鼻咽癌的發(fā)生[1]。目前已公認(rèn)，放療是治療鼻咽癌的主要手段。雖然隨著醫(yī)療水平的提高和放療設(shè)備及技術(shù)的更新，鼻咽癌的療效有了明顯提高，但放療后緩解的患者仍有約30%～40%因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療失敗[2]。因此，探求一種能有效監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的方法，對(duì)提高鼻咽癌患者的生存率有重要意義。本研究通過(guò)血漿EBV DNA和VCA-IgA兩種腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)來(lái)探討其在監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月～2015年1月，初診在我院耳鼻咽喉科病理確診后接受根治性放療的鼻咽癌患者68例，其中男47例，女性21例，年齡21～78歲，中位年齡48歲。放療結(jié)束后每3個(gè)月隨訪1次，截止時(shí)間為2016年1月。隨訪時(shí)對(duì)患者進(jìn)行常規(guī)體檢及間接鼻咽鏡、鼻咽CT、胸片、腹部B超檢查，對(duì)可疑局部復(fù)發(fā)者則行纖維鼻咽鏡活檢，可疑遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者加用其他檢查手段。在隨訪過(guò)程中，經(jīng)臨床檢查證實(shí)放療后緩解42例，局部復(fù)發(fā)10例，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16例。分別采取放療前組（初診）、放療后緩解組和放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組患者清晨空腹肘靜脈血5 ml，放入EDTA抗凝管中，離心分離得血漿，置于-20℃凍存待測(cè)。

1.2方法 樣本DNA抽提與熒光定量PCR反應(yīng)。凍存的血漿置于4℃解凍，每例標(biāo)本取50ul血漿，用QIAamp血液DNA提取試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）抽提DNA。抽提方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)測(cè)定血漿EBV DNA水平。EB病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，包括DNA提取液、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品以及PCR反應(yīng)管等。用上海楓林FTC-2000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟、結(jié)果判斷以及質(zhì)量控制方法按廠家說(shuō)明。血漿EBV DNA>0 copies/ml為陽(yáng)性。

1.3免疫酶法檢測(cè)血清VCA-IgA滴度 用常規(guī)的免疫酶法檢測(cè)血清VCA-IgA滴度。血漿VCA-IgA滴度≥1∶10為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用中位數(shù)表示，樣本比較用u檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1放療前組患者血漿EBV DNA含量和VCA-IgA滴度。68例初診鼻咽癌患者血漿EBV DNA陽(yáng)性率為95.59%（65/68），假陰性率為4.41%（3/68），中位拷貝數(shù)為93×104 copies/ml（0-248×108 copies/ml）；血漿VCA-IgA陽(yáng)性率為88.24%（60/68），假陰性率為11.76%（8/68），其中滴度（<1∶10）8例，低滴度（1∶10-1∶20）11例，中滴度（1∶40-1∶160）38例，高滴度（>1∶160）11例。

2.2放療后緩解組患者血漿EBV DNA含量和VCA-IgA滴度。42例放療后緩解的鼻咽癌患者血漿EBV DNA陽(yáng)性率為16.67%（7/42），中位拷貝數(shù)為0 copies/ml（0～236×103 copies/ml）；血漿VCA-IgA陽(yáng)性率為54.76%（23/42），其中滴度（<1：10）19例，低滴度（1∶10-1∶20）19例，中滴度（1∶40-1∶160）3例，高滴度（>1∶160）1例。在7例EBV DNA陽(yáng)性的患者中，有4例處于高拷貝狀態(tài)，其VCA-IgA滴度亦處于中高滴度，后在隨訪過(guò)程中確診為局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，另外3例無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的臨床證據(jù)。

2.3放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組患者血漿EBV DNA含量和VCA-IgA滴度。26例放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組患者血漿EBV DNA陽(yáng)性檢出率92.31%（24/26），中位拷貝數(shù)為69×105 copies/ml（0-256×108 copies/ml），26例患者中2例血漿EBV DNA檢測(cè)陰性，假陰性率為7.69%（2/26），余25例大多數(shù)處于高拷貝狀態(tài)。血漿VCA-IgA陽(yáng)性率為88.46%（23/26），假陰性3例，假陰性率為7.69%（3/26），余23例多處于中高滴度狀態(tài)，其中血漿EBV DNA檢測(cè)為陰性的2例鼻咽癌患者VCA-IgA處于高滴度狀態(tài)。

2.4各組血漿EBV DNA陽(yáng)性檢出率和濃度比較，見(jiàn)表1。

放療前組EBV DNA 陽(yáng)性率顯著高于放療后緩解組（u=8.46，P<0.01），與復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組比較無(wú)顯著性差異（u=0.63，P>0.05）；復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組與放療后緩解組比較差異顯著（u=6.10，P<0.01）。

2.5各組血漿VCA-IgA陽(yáng)性檢出率和滴度比較， 見(jiàn)表2，表3。

放療前組VCA-IgA陽(yáng)性率顯著高于放療后緩解組（u=3.96，P<0.01），與復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組比較無(wú)差異（u=0.03，P>0.05）；復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組與放療后緩解組比較有顯著性差異（u=2.89，P<0.01）。

3 討論

鼻咽癌是我國(guó)最為常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，具有明顯地域性和種族性差異[3]，我國(guó)華南地區(qū)為高發(fā)區(qū)。雖然病因尚不十分明確，但目前已證實(shí)EB病毒是鼻咽癌重要的致病因子，肯定參與鼻咽癌的多階段、多因素發(fā)生過(guò)程，被EB病毒感染的細(xì)胞具有EBV的基因組，并可產(chǎn)生各種抗原及相應(yīng)的抗體，對(duì)EB病毒各種抗原抗體及EBV-DNA的檢測(cè)，已作為鼻咽癌篩查及輔助診斷的手段廣泛用于臨床[4]。鼻咽癌具有包括對(duì)放療異常敏感、容易出現(xiàn)腫瘤殘存、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特殊的臨床病理特征。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者死亡的主要原因[5]，也是制約患者療效和預(yù)后的主要因素。目前鼻咽癌患者療效的監(jiān)測(cè)、局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷，主要依靠鼻咽鏡和影像學(xué)檢查。這些檢查不僅因費(fèi)用貴、耗時(shí)長(zhǎng)而致患者難以接受，還且因?yàn)橛跋駥W(xué)檢查為一種局部顯像技術(shù)，不可能檢測(cè)到每一個(gè)可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，也不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)疾病的進(jìn)展，其敏感性和特異性也較差，特別在診斷較小的轉(zhuǎn)移灶、放療后腫瘤侵潤(rùn)與纖維化的鑒別、以及殘存腫瘤性質(zhì)的判斷方面具有一定的局限性[2]。因此，找到能有效監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤標(biāo)記物可彌補(bǔ)這些缺陷。

本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)和免疫酶法分別檢測(cè)了放療前、放療后緩解及放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的鼻咽癌患者血漿中EBV DNA含量和VCA-IgA滴度，結(jié)果顯示放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組血漿EBV DNA含量和VCA-IgA滴度顯著高于放療后緩解組，且大多數(shù)患者血漿EBV DNA處于高拷貝狀態(tài)、VCA-IgA處于中高滴度狀態(tài)，而處于緩解期的血漿EBV DNA一直很低或檢測(cè)不到，說(shuō)明檢測(cè)血漿EBV DNA和VCA-IgA含量對(duì)監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者放療后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有重要的臨床意義。另外，在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移組中有2例EBV DNA陰性而VCA-IgA檢測(cè)為陽(yáng)性，3例VCA-IgA陰性而EBV DNA檢測(cè)為陽(yáng)性，說(shuō)明血漿EBV DNA和VCA-IgA的聯(lián)合檢測(cè)有互補(bǔ)作用。

本研究結(jié)果還顯示，放療前組血漿EBV DNA陽(yáng)性檢出率和中位拷貝數(shù)顯著高于放療后緩解組，而放療后緩解組大部分患者EBV DNA水平已檢測(cè)不到，提示鼻咽癌患者血漿EBV DNA水平隨放療前后腫瘤消長(zhǎng)而變化，與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)，即血漿EBV DNA可反映放療后殘余腫瘤的載量，此與相關(guān)報(bào)道相似[6-7]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者緩解組血漿VCA-IgA陽(yáng)性檢出率雖然較高，但隨放療后時(shí)間的增長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明EB病毒抗體在體內(nèi)會(huì)保持一定時(shí)間，即使體內(nèi)EBV被清除，在血漿中較長(zhǎng)時(shí)間仍可檢出該抗體，與曹素梅等[8]報(bào)道相近。

綜上所述，血漿EBV DNA和VCA-IgA兩種腫瘤標(biāo)記物的聯(lián)合檢測(cè)，是監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效方法，且因費(fèi)用低、省時(shí)方便而使患者易于接受，適合基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。但上述指標(biāo)的檢測(cè)均存在一定的假陰性，所以在臨床工作中尚需結(jié)合必要的臨床和影像學(xué)檢查資料，以便對(duì)放療后鼻咽癌患者復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)做出更準(zhǔn)確的判斷。

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