基于轉(zhuǎn)錄組序列的蕪菁SSR標(biāo)記開發(fā)及應(yīng)用

李曉娟，趙文菊，趙孟良，邵登魁，馬一棟，任延靖，*

(1.青海省農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，青海 西寧 810016)

蕪菁(Brassicarapassp.rapa)，屬于十字花科薹屬蕪菁亞種，是藥食兼用的蔬菜作物。蕪菁安全無毒，營養(yǎng)豐富，可以長期食用[1]。近代藥理研究還發(fā)現(xiàn)，蕪菁具有抗衰老[2]、抗氧化[3]、降血脂[4]等功效，在食品和藥用領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[5]。

分子標(biāo)記是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映，具有穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富、適用于不同組織及生物發(fā)育的不同階段、不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)且不受環(huán)境影響等優(yōu)點[6]，目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，其中簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種DNA標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、廣泛分布于基因組中等特點[7]，近年來被廣泛用于種質(zhì)資源及品種的遺傳多樣性分析和親緣分析、質(zhì)量性狀的精細(xì)定位及雜交種純度的鑒定等方面。

在十字花科蔬菜中，SSR標(biāo)記也被廣泛應(yīng)用于上述幾個方面，在白菜中，李桂花等[8]利用SRAP和SSR分子標(biāo)記對41份小白菜進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，在遺傳相似系數(shù)0.58處可將41份小白菜材料分為兩大類；徐營莉等[9]利用72對SSR分子標(biāo)記檢測了5個白菜類優(yōu)勢品種的種子純度，結(jié)果表明，72對SSR引物中篩選出5對具有多態(tài)性，能夠?qū)⒏副竞碗s交種分開；何曉麗等[10]利用SSR分子標(biāo)記與農(nóng)藝性狀結(jié)合，分析了54份類型差異大、有南方特色的不結(jié)球白菜，在遺傳距離0.6處將54份不結(jié)球白菜分為了3個類型。在芥菜中，李永平等[11]利用芥菜轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR分子標(biāo)記，并隨機(jī)選取50對引物擴(kuò)增44份芥菜種質(zhì)，結(jié)果顯示，SSR標(biāo)記效率高、擴(kuò)增條帶性豐富；顏新林等[12]構(gòu)建了基于SSR標(biāo)記的芥菜品種鑒定技術(shù)體系，最終篩選出24對SSR引物作為核心引物用于芥菜品種真實性快速鑒定和遺傳多樣性分析；胡齊贊等[13]利用14對SSR分子標(biāo)記對81份地方芥菜種質(zhì)資源進(jìn)行了多樣性分析，將這些種質(zhì)分為了2個類群。

目前關(guān)于蕪菁在基因組水平上的遺傳多樣性的研究還未見報道，本研究利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)適合蕪菁的SSR分子標(biāo)記，并對其遺傳多樣性進(jìn)行研究，為今后蕪菁種質(zhì)資源的評價和親緣關(guān)系鑒定奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究收集了50份蕪菁種質(zhì)資源，具體信息見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組測序

采集蕪菁種質(zhì)資源W21和W25的不同發(fā)育時期的樣品，每個樣品3個重復(fù)，每個重復(fù)包含6個單株，委托武漢邁特維爾生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。建庫的方法參考公司已有的流程，首先獲取蕪菁的mRNA，隨后加入片段化緩沖液將RNA打斷成短片段，以短片段RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA 聚合酶I合成二鏈cDNA，隨后進(jìn)行雙鏈cDNA的純化，純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR富集得到最終的cDNA文庫，獲得的cDNA文庫首先進(jìn)行檢測，檢測方法包括使用Qubit2.0進(jìn)行初步定量，使用Agilent 2100對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，插入片段符合預(yù)期后采用q-PCR方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，庫檢合格后，用Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序[14]。

1.2.2 基因組DNA的提取

試驗材料種植于青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院園藝所1號試驗基地內(nèi)，待蕪菁成熟時選取蕪菁新鮮的幼嫩葉片，液氮冷凍研磨，采用改良的CTAB法[15]提取基因組DNA。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計與合成

采用MISA軟件對蕪菁轉(zhuǎn)錄組的Unigene基因進(jìn)行SSR檢測，搜索條件為單堿基(mono-nucleotide)重復(fù)SSR、雙堿基(di-nucleotide)重復(fù)SSR、三堿基(tri-nucleotide)重復(fù)SSR、四堿基(tetra-nucleotide)重復(fù)SSR、五堿基(penta-nucleotide)重復(fù)SSR和六堿基(hexa-nucleotide)重復(fù)SSR，最低重復(fù)次數(shù)分別為10、6、5、5、5、5次。從蕪菁10條染色體上各隨機(jī)選擇3條unigenes序列，利用Primer3軟件設(shè)計引物，隨機(jī)挑選的30對引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 供試材料信息

1.2.4 PCR擴(kuò)增及結(jié)果檢測

20 μL PCR反應(yīng)體系包括：DNA模板1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 5 μL，上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。采用8%非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用人工讀帶的方法，將聚丙烯酰胺電泳圖上可重復(fù)的清晰條帶記為“1”，同一位置條帶較弱或者無條帶的記為“0”，以此建立原始數(shù)據(jù)的0-1矩陣。通過Popgene1.31和PIC-CALC軟件進(jìn)行SSR位點的遺傳多樣性分析，利用NTSYS-pc1.0軟件進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕪菁轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的分布及特點

通過對蕪菁的253 720條unigene序列(序列總長為250 929.08 kb)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在63 553條unigene序列中含有79 716個SSR位點，其中13 247條unigene中含有2個或2個以上SSR位點。SSR的發(fā)生頻率(含SSR的unigene基因數(shù)/總unigene條數(shù))為25.05%，平均每3.15 kb出現(xiàn)1個SSR，分布頻率(SSR個數(shù)與總unigene條數(shù)之比)31.42%。SSR位點搜索結(jié)果顯示，有單一SSR位點(每個位點僅包含一種類型的SSR)和復(fù)雜SSR位點(每個位點包含至少兩種類型的SSR)兩種類型，以單一SSR位點為主，有54 482個，占比68.35%，其中單核苷酸重復(fù)是主要類型，占總SSR位點的31.1%；其次是三核苷酸和二核苷酸重復(fù)，分別占19.46%和16.88%；四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重復(fù)類型數(shù)量最少，分別為0.58%、0.16%和0.17%。所有單一SSR位點中，10次重復(fù)的SSR位點最多，共16 979個，占總單一SSR位點數(shù)的31.16%；9次重復(fù)的SSR位點最少，只有1 650個，僅占總數(shù)的3.03%(表2)。蕪菁SSR位點長度從10～308 bp不等，總長1 508 444 bp，平均長度18.92 bp；其中長度在10～24 bp的SSR位點數(shù)量最多，有71 348個，占總數(shù)的89.50%，長度>25 bp的有8 368個，占總數(shù)的10.50%。

表2 蕪菁單一SSR的類型、數(shù)量及分布特征

2.2 蕪菁轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)類型和頻率特征

從蕪菁轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序類型(表3)看，54 482個SSR位點包括266個重復(fù)基元，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型分別有4、12、60、81、54和55種。根據(jù)堿基互補配對原則和閱讀起始堿基順序的差異[16]，對每種長度類型的重復(fù)基元進(jìn)行同類兼并后，單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元類型分別為2、4、10、26、26和44個，單核苷酸重復(fù)基序最多，包括A/T和C/G，其中A/T數(shù)量最多，占總SSR位點的45.24%；二核苷酸重復(fù)中，AG/GT數(shù)量最多，有9 288個，占總SSR位點的17.05%；三核苷酸重復(fù)中，AAG/CTT和AGG/CCT數(shù)量最多，分別有5 054和2 656個，占總SSR位點的9.28%和4.88%；四、五、六核苷酸重復(fù)中，基序數(shù)量較多，沒有發(fā)現(xiàn)數(shù)量上有較為顯著的基序類型(表3)。

表3 蕪菁SSR基序類型分布

2.3 引物篩選及應(yīng)用

從分布在蕪菁10條染色體上SSR引物中隨機(jī)選30對(表4)，以50份蕪菁葉片DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過聚丙烯酰胺電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果(圖1)。30對引物最終均獲得了多態(tài)性高、條帶清晰的結(jié)果，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶126條，平均每對引物擴(kuò)增出4.2條，平均多態(tài)率100%。

表4 蕪菁SSR引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

序號同表1。The numbers of 1-50 were the same as in Table 1.圖1 部分引物在50份供試材料的電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis result of 50 tested materials with partial primers

擴(kuò)增條帶最多的引物是Cluster-30924.76636，為13條，最少的是Cluster-30924.104122、Cluster-30924.109584、Cluster-30924.120390、Cluster-30924.22191、Cluster-30924.48364和Cluster-30924.93982，只有1條。根據(jù)電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，最終得到24對多態(tài)性高、條帶清晰的蕪菁SSR引物，占總引物的80%。

2.4 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果見表5，24對SSR引物在50份蕪菁材料中共擴(kuò)增獲得了101個等位基因，每個位點等位基因數(shù)(Na)為2～7個，平均每個位點等位基因數(shù)4.21個，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.4817個，有效等位變異率(有效等位基因數(shù)占觀測等位基因數(shù)的比例)為35.19%。其中引物Cluster-30924.164312的有效等位基因數(shù)最多為1.856 3個，引物Cluster-30924.87846的有效等位基因數(shù)最少為1.020 3個。期望雜合度(h)的平均值是0.287 0，最大位點是Cluster-30924.164312，最小位點是Cluster-30924.87846，變化范圍是0.019 9～0.455 1；多樣性指數(shù)(I)分布在0.056 2～0.646 0，平均值為0.438 5；多態(tài)性信息含量(PIC)變化范圍為0.038 4～0.914 7，平均為0.569 1，其中有14對引物的多態(tài)性信息含量大于0.5，屬于高多態(tài)性引物，占總引物數(shù)的46.67%。結(jié)果表明，通過24對引物能夠揭示50份蕪菁資源的遺傳多樣性。

2.5 聚類分析

根據(jù)30對引物的擴(kuò)增結(jié)果，采用最大似然法對50個蕪菁材料進(jìn)行聚類分析。結(jié)果可知(圖2)，50個供試蕪菁材料的遺傳背景較為復(fù)雜。在遺傳距離大于20的地方，將50份蕪菁材料分為四大類，第一類包含7份材料，分別是W22、IC22、T17、1402、W25、IC23和IC28，這7份材料在形態(tài)學(xué)上差異極大；第二類包括40份材料，占總供試材料的80%，第二類又可以分為兩小類，分別包含28份和12份材料；第三類包括了2份材料，分別為T4和NS1；第四類僅包括1份材料，IC9。

表5 二十四對SSR引物的遺傳參數(shù)

圖2 五十份蕪菁材料SSR標(biāo)記的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 50 varieties of the turnip based on SSR markers

3 結(jié)論與討論

蕪菁為十字花科蕓薹屬蕓薹種蕪菁亞種能形成肉質(zhì)根的2 a生草本植物，具有很多重要的遺傳特性[17]，它是具有較長歷史的藥食同源類植物，不僅可提供人體必需的各種氨基酸，還可降低各種疾病的發(fā)病率，提高免疫力。因此對蕪菁進(jìn)行遺傳多樣性分析，是很有必要的。

轉(zhuǎn)錄組測序能夠快速、準(zhǔn)確地獲得物種全轉(zhuǎn)錄本序列信息，不依賴于物種的全基因組信息，且價格低廉，在不同物種的分子標(biāo)記開發(fā)中已被廣泛應(yīng)用[18-19]，而SSR標(biāo)記是很好的共顯性標(biāo)記，多態(tài)性豐富且位點單一穩(wěn)定，標(biāo)記帶型簡單，是很好的錨定標(biāo)記，有助于染色體的歸并和不同連鎖群的整合[20]，轉(zhuǎn)錄組序列多集中在功能基因上，因此基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR標(biāo)記有利于后期與重要性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，這也為分子標(biāo)記輔助育種工作中親本選育過程節(jié)約了時間和成本[21]。因此SSR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于各類蔬菜和水果中，張春紅等[22]利用SSR標(biāo)記分析藍(lán)莓(Vacciniumcorymbosum)現(xiàn)有品種種質(zhì)的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)品種間遺傳差異較豐富，利用UPGMA聚類以及結(jié)合不同類型種質(zhì)的系譜分析，發(fā)現(xiàn)分類與品種種質(zhì)的遺傳成分相似有一定的相關(guān)；劉新雨等[23]利用大蒜(Alliumsativum)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析，在遺傳相似系數(shù)0.756 9處，35份大蒜資源可被分成5大類群；楊亮等[24]為探究收集于國內(nèi)外不同番茄(Solanumlycopersicum)種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，選用48對SSR引物對856份番茄材料進(jìn)行遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)番茄果實大小將其分為野生番茄(7份)、櫻桃番茄(207份)及栽培型番茄(642份)3大類群，通過群體結(jié)構(gòu)分析將856份材料劃分為4個類群，兩種類群劃分有相似的結(jié)果。李延龍等[25]利用MISA軟件篩選韭菜(Alliumtuberosum)全長轉(zhuǎn)錄組測序檢測出的SSR位點，設(shè)計了3 311對SSR引物，隨機(jī)選取164對引物(78.85%)進(jìn)行擴(kuò)增試驗，39對引物在24株韭菜中表現(xiàn)出多態(tài)性種質(zhì)資源。

本研究對蕪菁轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行了SSR位點檢測與信息分析，并通過PCR擴(kuò)增檢測引物有效性和多態(tài)性。研究結(jié)果表明，在63 553條unigene序列中含有79 716個SSR位點，其中13 247條unigene中含有2個或2個以上SSR位點。SSR的發(fā)生頻率為25.05%，平均每3.15 kb出現(xiàn)1個SSR，分布頻率為31.42%。通過聚丙烯酰胺電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果顯示，30對引物最終均獲得了多態(tài)性高、條帶清晰的結(jié)果，共擴(kuò)增出多態(tài)性條帶126條，平均每對引物擴(kuò)增出4.2條，平均多態(tài)率100%。根據(jù)電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，最終得到24對多態(tài)性高、條帶清晰的蕪菁SSR引物，占總引物的80%，24對SSR引物在50份蕪菁材料中共擴(kuò)增獲得了101個等位基因，每個位點等位基因數(shù)(Na)為2～7個，平均每個位點等位基因數(shù)4.21個，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.481 7個，有效等位變異率為35.19%，表明篩選出的引物能較好地表現(xiàn)50份蕪菁的遺傳多樣性。

綜上所述，本研究采用SSR分子標(biāo)記方法，揭示了蕪菁的遺傳多樣性，并篩選出了適合蕪菁種質(zhì)資源評價鑒定的EST-SSR引物，在蕪菁的資源多樣性分析、雜交種鑒定及遺傳圖譜的構(gòu)建應(yīng)用中具有重要意義。