基于mtDNA Cyt b序列變異探究柴達(dá)木黃牛的母系遺傳多樣性及遺傳背景

楊秋蕾，魏旭東，馬志杰,*，陳生梅，晁生玉，烏蘭巴特爾

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海省海西州農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，青海 德令哈 817099)

線粒體基因組(mtDNA)的結(jié)構(gòu)特征與遺傳特性使其在哺乳動(dòng)物種群識(shí)別、遺傳多樣性保護(hù)以及母系起源進(jìn)化等研究中能夠作為可靠的分子標(biāo)記而被廣泛應(yīng)用。mtDNACytb基因的進(jìn)化速率適中，包含從種內(nèi)到種間乃至科間的遺傳信息[1]，因此，該基因已被廣泛用于探究哺乳動(dòng)物、鳥類和兩棲動(dòng)物等的母系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及起源等研究[2]。

柴達(dá)木黃牛是《中國(guó)畜禽遺傳資源志·牛志》中唯一收錄的青海省黃牛地方品種[3]。先前對(duì)柴達(dá)木黃牛生化水平的研究中，張才駿等[4-5]對(duì)柴達(dá)木黃牛血液生化遺傳標(biāo)記進(jìn)行了多態(tài)性檢測(cè)，表明在柴達(dá)木黃牛中有11種生化標(biāo)記存在多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木黃牛與青海省東部黃牛存在最近的親緣關(guān)系，與北方牛系蒙古牛、延邊牛和安西牛具有較近的親緣關(guān)系。才仁山德布等[6]對(duì)德令哈市56頭柴達(dá)木黃牛和17頭雜種黃牛的α-乳白蛋白(α-LA)和β-乳球蛋白(β-LG)進(jìn)行分析，表明柴達(dá)木黃牛的α-LA和β-LG位點(diǎn)均具有多態(tài)性，但α-LA位點(diǎn)的基因雜合度很低。在柴達(dá)木黃牛父系分子遺傳研究中，馬志杰等[7-9]基于Y染色體USP9Y、ZFY-10和UTY-19標(biāo)記的遺傳變異對(duì)柴達(dá)木黃牛的父系遺傳結(jié)構(gòu)、多樣性及遺傳背景進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木黃牛含有Y1和Y2兩個(gè)普通牛父系支系，表明其為普通牛起源。在柴達(dá)木黃牛全基因組研究中，閆碧瑤[10]對(duì)9頭柴達(dá)木黃牛進(jìn)行全基因組重測(cè)序，并與秦川牛、西門塔爾牛、荷斯坦牛、日本和牛、娟珊牛、紅安格斯牛和韓牛進(jìn)行基因組比對(duì)分析，表明柴達(dá)木黃牛與以上7個(gè)黃牛品種具有明顯的遺傳差異，與秦川牛分化指數(shù)最小。Chen等[11]基于全基因組重測(cè)序方法對(duì)包括5頭柴達(dá)木黃牛在內(nèi)的世界家牛遺傳多樣性及起源進(jìn)行綜合分析表明，柴達(dá)木黃牛與西藏牛、蒙古牛、延邊牛以及哈薩克牛間的親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)。在中國(guó)其他黃牛母系遺傳研究中，雷初朝等[12]分析了我國(guó)8個(gè)黃牛品種的mtDNA D-loop區(qū)全序列，確定了19種單倍型，提示中國(guó)黃牛mtDNA遺傳多態(tài)性非常豐富；聚類分析揭示中國(guó)黃?？赡苡?個(gè)母系起源，以普通牛和瘤牛起源為主。Lai等[13]指出中國(guó)黃牛中普通牛有T2、T3和T4三種單倍型組，瘤牛包含I1和I2兩種單倍型組，瘤牛和普通牛的分歧時(shí)間大約是在公元前14 100—44 500年，提示中國(guó)南方黃牛和西南地區(qū)黃牛受瘤牛的影響大。Cai 等[14]分析了我國(guó)18個(gè)本地黃牛品種的Cytb基因序列，發(fā)現(xiàn)南方黃牛和北方黃牛分別以瘤牛(63.3%～100%)和普通牛(81.8%～100%)mtDNA占主導(dǎo)，中國(guó)黃牛分為普通牛和瘤牛2大支系。Xia等[15]分析了1 105個(gè)中國(guó)黃牛的mtDNA D-loop序列，結(jié)果表明，中國(guó)黃牛起源于普通牛和瘤牛，蒙古牛對(duì)中國(guó)牛的影響較大，并發(fā)現(xiàn)西藏牛中有牦?；驖B入。

綜上所述，研究者已基于生化標(biāo)記、父系分子遺傳標(biāo)記以及全基因組序列變異初步探究了柴達(dá)木黃牛的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和起源，但尚未見基于mtDNA序列變異對(duì)柴達(dá)木黃牛母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及遺傳背景等問(wèn)題的研究，故本研究基于mtDNACytb基因的遺傳變異探究柴達(dá)木黃牛的母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)和遺傳背景等問(wèn)題，為今后開展柴達(dá)木黃牛的保種及其合理開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

在青海省海西蒙古族藏族自治州柴達(dá)木黃牛的5個(gè)主產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集血樣或耳組織，其中格爾木市88頭(40♂、48♀)、烏蘭縣59頭(15♂、44♀)、都蘭縣62頭(23♂、39♀)、茫崖市33頭(19♂、14♀)和大柴旦行政區(qū)26頭(5♂、21♀)，共采集268頭柴達(dá)木黃牛的樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室。采樣前詢問(wèn)牧戶有關(guān)牛群的選育背景信息并查閱系譜記錄情況，確保樣品間無(wú)親緣關(guān)系且具有代表性。使用基因組DNA提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 mtDNA Cyt b基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

參照Irwin等[16]報(bào)道的普通牛Cytb基因擴(kuò)增引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成柴達(dá)木黃牛Cytb基因的擴(kuò)增引物，其中上游引物為：5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′，下游引物為：5′-GGAATTCATCTCTCCCGGTTTACAAGAC-3′， PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度為1 210 bp左右。PCR體系為：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司) 13 μL，上、下游引物 (10 pmol·L-1) 各1 μL，基因組DNA(25～50 pmol·L-1) 1 μL，超純水9 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)，后冷卻至4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并純化回收，送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行正、反向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序結(jié)果用Chromas 2.6.4軟件進(jìn)行核實(shí)和校正，得到每頭柴達(dá)木黃牛的Cytb基因序列結(jié)果。用BioEdit7.2.5軟件[17]進(jìn)行多序列比對(duì)分析，檢測(cè)核苷酸變異位點(diǎn)。通過(guò)DnaSP 5.0軟件[18]依據(jù)該基因核苷酸變異確定不同個(gè)體的單倍型，再用 Arlequin 3.0軟件[19]進(jìn)行群體單倍型多樣度和核苷酸多樣度的計(jì)算分析。柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間的固定指數(shù)(fixation index， Fst)通過(guò)Arlequin 3.11軟件計(jì)算獲得，以揭示品種內(nèi)群體間的分化狀況。Rst值通過(guò)線性化的Fst值計(jì)算獲得，即Rst=Fst/(1-Fst)。基于Rst值使用MEGA 5.0軟件[20]構(gòu)建柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)不同群體間的親緣關(guān)系聚類圖，以揭示品種內(nèi)各群體間的聚類情況和遺傳關(guān)系。同時(shí)，從GenBank中下載普通牛(AY903438)、瘤牛(DQ186290)和牦牛(EU807949)的Cytb基因全序列作為參考序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)，不同單倍型序列間的中介網(wǎng)絡(luò)圖由Network 10.1軟件[21]完成，以揭示不同單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴達(dá)木黃牛母系遺傳多樣性分析

測(cè)序結(jié)果表明，柴達(dá)木黃牛Cytb基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 140 bp。對(duì)268頭柴達(dá)木黃牛mtDNACytb基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)茫崖、烏蘭、都蘭各群體均有1頭黃牛為牦牛mtDNACytb序列類型，占總頭數(shù)的1.12%，說(shuō)明這3個(gè)縣(市)的柴達(dá)木黃牛一定程度上受到了牦?；驖u滲的影響。除去3條牦牛mtDNACytb類型序列，對(duì)共計(jì)265頭柴達(dá)木黃牛Cytb基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)綜合分析，共檢測(cè)到29個(gè)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(圖1)，其中單一多態(tài)位點(diǎn)4個(gè)，分別為121、242、573和906位點(diǎn)，占分析序列總長(zhǎng)度的0.35%；簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)25個(gè)，依次是66、67、93、232、312、345、384、592、621、633、774、795、813、834、835、997、1 035、1 050、1 066、1 080、1 092、1 104、1 112、1 114和1 116位點(diǎn)，約占分析序列長(zhǎng)度的2.19%。共確定了12種單倍型，其中H2為優(yōu)勢(shì)單倍型，有161個(gè)個(gè)體共享。H1與H3各有31個(gè)和45個(gè)個(gè)體共享，H5和H4分別有10個(gè)和7個(gè)個(gè)體共享，H11單倍型僅有3個(gè)個(gè)體共享，H7和H10分別有2個(gè)個(gè)體共享，而H6、H8、H9和H12分別由1個(gè)個(gè)體擁有，為稀有單倍型。

“.”代表與H1單倍型序列中的核苷酸相同?！?”represented the same nucleotides as in H1 haplotype sequences.圖1 柴達(dá)木黃牛Cyt b基因12種單倍型序列核苷酸變異及其分布Fig.1 Distribution and nucleotide variations of 12 haplotypes based on Cyt b of Qaidam cattle

由表1可以看出，柴達(dá)木黃牛的單倍型多樣度為0.588 2±0.030 0，核苷酸多樣度為0.004 0±0.002 2。在柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)，分別在格爾木、烏蘭、都蘭、大柴旦和茫崖群體中確定了4、3、9、4、7種單倍型。5個(gè)群體即格爾木、烏蘭、都蘭、大柴旦和茫崖各群體的單倍型多樣度依次為0.599 5±0.040 4、0.329 7±0.073 3、0.713 1±0.042 3、0.452 3±0.108 8和0.695 6±0.079 6，而核苷酸多樣度分別為0.103 99±0.062 4、0.011 20±0.013 2、0.188 61±0.102 0、0.103 99±0.062 4和0.179 22±0.099 1，表明都蘭和茫崖這2個(gè)群體相比格爾木、大柴旦和烏蘭這3個(gè)群體具有更高的母系遺傳多樣性，群體遺傳變異相對(duì)豐富。

2.2 柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間遺傳分化及聚類關(guān)系分析

柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)5個(gè)群體間固定分化指數(shù)Fst值結(jié)果見表2，其中格爾木群體與烏蘭群體間分化程度最大(Fst=0.161 8)，大柴旦群體和茫崖群體間的分化程度最小(Fst=-0.010 4)。

表1 基于Cyt b序列變異的柴達(dá)木黃牛核苷酸多樣度和單倍型多樣度大小

表2 柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間Fst值(下三角)和Rst值(上三角)

格爾木群體與都蘭、大柴旦、茫崖群體間的分化指數(shù)依次為-0.004 5、0.035 0和0.019 8，烏蘭群體與都蘭、大柴旦、茫崖群體間的分化指數(shù)分別為0.124 9、0.063 5和0.128 6，都蘭群體與大柴旦、茫崖群體間的分化指數(shù)分別為0.002 9和0.000 2。

基于相應(yīng)的Rst值用MEGA 5.0軟件使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)構(gòu)建柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)5個(gè)群體間遺傳關(guān)系圖，聚類結(jié)果表明：5個(gè)群體可聚為2類，其中格爾木群體與都蘭群體最先聚在一起，大柴旦群體與茫崖群體也最先聚為一起，隨后它們兩者再聚為1類，而烏蘭群體單獨(dú)為1類，2類最后聚為1大類(圖2)。

2.3 柴達(dá)木黃牛母系系統(tǒng)發(fā)育分析

以牦牛Cytb序列(GenBank登錄號(hào)：EU807949)為外群，普通牛(GenBank登錄號(hào)：AY903438)和瘤牛(GenBank登錄號(hào)：DQ186290)相應(yīng)序列作為參考序列，使用NJ(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)，利用MJ(median-joining)中介網(wǎng)絡(luò)圖對(duì)柴達(dá)木黃牛不同單倍型間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，柴達(dá)木黃牛12種單倍型包括9種普通牛單倍型(即H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H10和H12)和3種瘤牛單倍型(即H1、H9和H11)(圖3)，表明柴達(dá)木黃牛由普通牛和瘤牛2個(gè)母系遺傳支系組成，具有2個(gè)母系起源。

圖2 基于UPGMA法構(gòu)建的柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間遺傳關(guān)系聚類圖Fig.2 Clustering map of genetic relationship among populations of Qaidam cattle by UPGMA method

3 討論

3.1 柴達(dá)木黃牛的母系遺傳多樣性

柴達(dá)木黃牛分布在青海省海西蒙古族藏族自治州柴達(dá)木盆地，是我國(guó)優(yōu)良的地方黃牛品種之一，被列入省、國(guó)家級(jí)地方畜禽遺傳資源保護(hù)名錄[3]。近年來(lái)，柴達(dá)木黃牛這一地方黃牛品種存欄量從1980年的1.82萬(wàn)頭下降到2011年的9 248頭[22]。柴達(dá)木黃牛作為當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民重要的生產(chǎn)生活資料來(lái)源，在地方農(nóng)牧業(yè)發(fā)展和民族經(jīng)濟(jì)建設(shè)中曾發(fā)揮了重要的作用。但是，隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展特別是畜牧業(yè)發(fā)展需求的變化，在肉牛改良過(guò)程中，忽視了對(duì)柴達(dá)木黃牛品種資源的保護(hù)，導(dǎo)致柴達(dá)木黃牛雜種化程度變高、品種退化嚴(yán)重。因此，從分子水平上探究其遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)是實(shí)施合理保護(hù)和利用的基礎(chǔ)。在先前中國(guó)部分黃牛的研究中，Cai等[14]分析了中國(guó)18個(gè)本地黃牛品種136個(gè)個(gè)體的Cytb基因序列，表明18個(gè)中國(guó)黃牛品種的核苷酸多樣度在0.002 9～0.009 2，單倍型多樣度在0.333～1.000。在本研究中，排除3頭牦牛mtDNACytb類型序列的柴達(dá)木黃牛個(gè)體后，對(duì)265頭柴達(dá)木黃牛Cytb序列綜合分析共確定了12種單倍型，其核苷酸多樣度為0.004 0±0.002 2，單倍型多樣度為0.588 2±0.030 0。和Cai等[14]的研究結(jié)果相比，除延邊黃牛(單倍型多樣度為0.333)和蒙古牛(單倍型多樣度為0.524)的單倍型多樣度值低于柴達(dá)木黃牛的單倍型多樣度值(0.588 2)外，其他黃牛品種的單倍型多樣度值均高于柴達(dá)木黃牛，說(shuō)明柴達(dá)木黃牛相比中國(guó)大多數(shù)黃牛品種而言，其遺傳多樣性相對(duì)較低，但仍表現(xiàn)出較豐富的母系遺傳多樣性。在柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)，都蘭群體的單倍型多樣度值最高(0.713 1±0.042 3)，烏蘭群體的單倍型多樣度最低(0.329 7±0.073 3)，說(shuō)明都蘭群體的遺傳變異最為豐富，烏蘭群體的遺傳變異最小?？傮w來(lái)看，都蘭和茫崖這2個(gè)群體相比格爾木、大柴旦和烏蘭這3個(gè)群體具有更高的母系遺傳多樣性，表明都蘭和茫崖這2個(gè)群體遺傳變異相對(duì)更為豐富。

圖中圓面積大小與各單倍型頻率大小成正比。The size of the circle was proportional to the frequency of each haplotype.圖3 基于NJ法(a)和MJ法(b)構(gòu)建的柴達(dá)木黃牛12種單倍型間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系Fig.3 Phylogenetic relationship among 12 haplotypes of Qaidam cattle based on NJ (a) and MJ (b) methods

3.2 柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間遺傳分化狀況

固定指數(shù)(Fst)是衡量動(dòng)物群體間分化程度的主要指標(biāo)之一。在動(dòng)物群體遺傳學(xué)研究中，F(xiàn)st值的大小反映了群體間分化程度的高低。在本研究中，柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)5個(gè)群體間Fst值大小各不相同，在-0.010 4～0.161 8，提示柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間分化程度各不相同，存在差異。 Wright[23]認(rèn)為，F(xiàn)st值介于0～<0.05說(shuō)明群體間分化程度很弱，介于0.05～<0.15說(shuō)明群體間呈中等分化，介于0.15～0.25表明群體間分化程度大，而大于0.25說(shuō)明群體間分化程度極大。依據(jù)此判定標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)5個(gè)群體間分化情況進(jìn)行分析，說(shuō)明格爾木群體與烏蘭群體間分化程度大(Fst=0.161 8)，茫崖群體和大柴旦群體間的分化程度很弱(Fst=-0.010 35)。此外，大柴旦與烏蘭群體間、都蘭和烏蘭群體間、茫崖與烏蘭群體間的分化程度均達(dá)到中等水平，而格爾木與大柴旦、都蘭及茫崖群體間、大柴旦與都蘭、茫崖群體間以及都蘭與茫崖群體間分化程度都很弱。鑒于柴達(dá)木黃牛這個(gè)珍稀的高原黃牛品種整體來(lái)看具有較高的品種內(nèi)群體間遺傳分化，故應(yīng)及時(shí)設(shè)立保種場(chǎng)和保種區(qū)，建立保種核心群，加大柴達(dá)木黃牛的保種與選育實(shí)踐。同時(shí)通過(guò)全基因組、轉(zhuǎn)錄組和多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合分析挖掘其選育潛力，以發(fā)揮其種業(yè)優(yōu)勢(shì)。

3.3 柴達(dá)木黃牛的母系支系組成及遺傳背景

在本研究中，使用系統(tǒng)發(fā)育樹和中介網(wǎng)絡(luò)圖對(duì)柴達(dá)木黃牛的母系支系組成及遺傳背景進(jìn)行探究分析，結(jié)果顯示柴達(dá)木黃牛由12種單倍型組成，且12種單倍型分成了2個(gè)母系遺傳分支，分別由9種普通牛單倍型和3種瘤牛單倍型組成，表明柴達(dá)木黃牛由2個(gè)母系支系組成，擁有普通牛和瘤牛母系遺傳血統(tǒng)，具有2個(gè)母系起源。在先前的研究中，Chen等[11]和Xia等[15]在中國(guó)黃牛的遺傳多樣性及系統(tǒng)發(fā)育分析中，發(fā)現(xiàn)西藏黃牛品種擁有一定程度的牦?；驖B入。在本研究中，發(fā)現(xiàn)茫崖市、烏蘭縣和都蘭縣各有1頭柴達(dá)木黃牛個(gè)體擁有牦牛mtDNACytb類型序列，占總頭數(shù)的1.12%，說(shuō)明柴達(dá)木黃牛品種中一定程度上還存在少量牦牛基因滲入，這說(shuō)明在青藏高原高寒牧區(qū)，特別是在牦牛和黃牛共同生長(zhǎng)地，牦牛和黃牛間的種間基因交流在柴達(dá)木黃牛、西藏牛這些高原黃牛品種中均普遍存在。

4 結(jié)論

柴達(dá)木黃牛品種具有較豐富的母系遺傳多樣性，品種內(nèi)都蘭和茫崖這2個(gè)群體相比格爾木、大柴旦和烏蘭這3個(gè)群體具有更高的母系遺傳多樣性；柴達(dá)木黃牛品種內(nèi)群體間分化程度存在差異，品種內(nèi)部分群體間達(dá)到中等及中等以上分化程度；柴達(dá)木黃牛擁有普通牛和瘤牛母系遺傳血統(tǒng)，由2個(gè)母系支系組成，具有2個(gè)母系起源，以普通牛起源為主；柴達(dá)木黃牛品種存在一定程度的牦?；驖B入。