基于LC-MS/MS技術(shù)研究稻草替代部分玉米青貯對奶牛血漿代謝產(chǎn)物的影響

李婭楠，冶文興，朱相德，陳 林，徐曉鋒，張力莉

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

我國是世界上最大的水稻種植國家[1]，稻草作為我國主要的農(nóng)作物秸稈來源之一，是不可忽視的可再生資源[2]。稻草最具環(huán)保性的資源化利用方式之一是作為動物的粗飼料，但因稻草粗纖維含量高，蛋白質(zhì)含量低，消化利用率低[3]，從而限制了其在養(yǎng)殖中的廣泛應(yīng)用。反芻動物瘤胃內(nèi)進(jìn)行著一系列以微生物為主導(dǎo)的消化代謝反應(yīng)，瘤胃也是目前自然界公認(rèn)的木質(zhì)纖維素高效降解和利用的天然反應(yīng)器，其真菌和細(xì)菌可分泌多種木質(zhì)纖維素降解酶，復(fù)雜多樣的微生物能夠利用飼料中的纖維類物質(zhì)，提高飼料的利用率[4]。研究表明，單獨飼喂稻草無法提供充足的營養(yǎng)，但稻草可以作為替代飼料配合其他優(yōu)質(zhì)飼料用于反芻動物的日糧中[5]，在節(jié)約成本的同時也能提高對稻草資源的利用。

代謝物作為代謝的終端產(chǎn)物，能夠更加直觀地反映出生物的代謝狀態(tài)，有助于了解代謝紊亂背后機(jī)制，代謝組學(xué)已經(jīng)被證明是表征代謝物動態(tài)變化的有效手段[6-8]，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品等領(lǐng)域[9]。血液作為機(jī)體重要的媒介液體，含有很多由機(jī)體代謝產(chǎn)生并聯(lián)系不同器官組織的代謝產(chǎn)物[10]，具有重要研究意義。目前，關(guān)于日糧改變對奶牛的影響的研究主要集中在對生產(chǎn)性能、瘤胃降解率、消化利用率等指標(biāo)的測定[11-12]，使用代謝組學(xué)方法探究日糧改變對奶牛代謝產(chǎn)物的影響的研究相對較少。因此，本試驗采用LC-MS/MS技術(shù)分析稻草替代部分玉米青貯后奶牛血漿代謝產(chǎn)物的變化，旨在探討稻草替代部分玉米青貯作為飼料組成對奶牛血漿代謝產(chǎn)物的影響，為稻草資源在奶牛日糧中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與管理

試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計方法，選取8頭體況良好，體重[(550±10)kg]、胎次[(2.64±0.70)胎]、產(chǎn)奶量[(24.1±3.9) kg·d-1]相近的泌乳后期中國荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為2組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)1頭。對照組(CS)粗飼料由苜蓿青貯、苜蓿、全株玉米青貯組成；試驗組(RSc)粗飼料由稻草替代1/3的全株玉米青貯，其他同試驗組。日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。采用全混合日糧(TMR)飼喂，自由飲水。試驗期共35 d，其中預(yù)試期14 d，正試期21 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 試驗儀器與試劑

質(zhì)譜儀(Thermo Fisher，Q ExactiveTM HF)；色譜儀(Thermo Fisher，Vanquish UHPLC)，C18色譜柱(Thermo Fisher，Hypesil Gold column，100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；低溫離心機(jī)(Scilogex，D3024R)；甲醇、甲酸、醋酸銨(LC-MS Grade，Thermo Fisher)；水(LC-MS Grade，Merck)。

1.3 血液采集及預(yù)處理

于試驗第35天晨飼前尾靜脈采血，將血液樣本收集至含肝素鈉抗凝的真空采血管中，以3 000×g、4 ℃離心15 min分離得到血漿。取血漿100 μL置于EP管中，加入400 μL質(zhì)譜級甲醇沉淀蛋白，渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000×g、4 ℃離心10 min，取一定量(425 μL)的上清加質(zhì)譜級水稀釋至甲醇含量為53%，并置于離心管中15 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清，進(jìn)行分析。

1.4 LC-MS/MS分析

1.4.1 色譜分離條件

柱溫40 ℃，流速0.2 mL·min-1。正離子模式流動相 A：0.1%甲酸，流動相 B：甲醇；負(fù)離子模式流動相 A：5 mmol·L-1醋酸銨(pH 9.0)，流動相 B：甲醇。梯度洗脫程序見表2。

1.4.2 質(zhì)譜條件

掃描范圍選擇m/z70～1 050；電噴霧源(ESI)設(shè)置如下：噴霧電壓(spray voltage)3.2 kV；鞘氣流速(sheath gas flow rat)40 arb；輔助氣流速(aux gas flow rate)10 arb；毛細(xì)管溫度(capillary temp)320 ℃。極性(polarity)：正離子(positive)、負(fù)離子(negative)；MS/MS 二級掃描為數(shù)據(jù)依賴掃描(data-dependent scans)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

將數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入 Compound Discoverer 3.1 (CD3.1， Thermo Fisher) 搜庫軟件中進(jìn)行預(yù)處理，包括峰對齊、峰提取、峰面積定量、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化等，最 后得到數(shù)據(jù)的鑒定和定量結(jié)果。預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0進(jìn)行多元化統(tǒng)計分析，包括：主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)；在建立模型的過程中對數(shù)據(jù)進(jìn)行置換檢驗以及變量投影重要度(VIP)的計算。在上述基礎(chǔ)上對數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量統(tǒng)計分析，包括差異倍數(shù)(FC)分析以及獨立樣本t檢驗。將VIP>1、P<0.05、FC>1.5 或 FC<0.667作為差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)。聚類分析采用Origin 2018進(jìn)行。

表2 色譜梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

PCA得分圖(圖1)表明，CS組與RSc組在正離子模式下和負(fù)離子模式下，組內(nèi)樣本能夠聚集到一起，且兩組樣本之間有明顯分離趨勢，說明RSc組奶牛與CS組奶牛的血漿代謝物存在差異。

圖1 CS組和RSc組PCA得分圖Fig.1 PCA scores of CS group and RSc group

2.2 OPLS-DA分析

構(gòu)建有監(jiān)督的OPLS-DA模型，進(jìn)一步判定兩組數(shù)據(jù)之間是否存在差異。OPLS-DA模型得分圖(圖2)表明，兩組樣本間有明顯的分離趨勢。正、負(fù)離子模式下，R2Y和Q2均接近于1，說明所建模型具有良好的解釋率和預(yù)測能力，符合原始樣本的真實情況。從OPLS-DA置換檢驗圖(圖3)可以看出，正離子模式下數(shù)據(jù)置換檢驗截距=-0.88(Q2intercept<0)，負(fù)離子模式下數(shù)據(jù)置換檢驗截距=-0.76(Q2intercept<0)，說明所建模型的穩(wěn)定性良好，不存在過度擬合現(xiàn)象。

R2Y代表模型在Y軸方向的解釋率，Q2代表模型的預(yù)測能力。R2Y represented the interpretation rate of the model in the Y-axis direction， and Q2 represented the prediction ability of the model.圖2 CS組和RSc組OPLS-DA得分圖Fig.2 OPLS-DA scores of CS group and RSc group

Q2intercept和R2intercept表示Q2和R2回歸直線與Y軸的截距。Q2intercept and R2intercept represented the intercept between Q2 and R2 regression lines and the Y-axis.圖3 CS組和RSc組置換檢驗圖Fig.3 Replacement test chart of CS group and RSc group

2.3 差異代謝物的篩選

以VIP>1、P<0.05和差異倍數(shù)(FC)>1.5 或 FC<0.667為差異代謝物篩選條件，共篩選出41種差異代謝物，其中正離子模式下26種(表3)，負(fù)離子模式下15種(表4)。

表3 正離子模式下試驗組和對照組鑒定出的差異代謝物

表4 負(fù)離子模式下試驗組和對照組鑒定出的差異代謝物

2.4 差異代謝物聚類分析

為了更直觀地呈現(xiàn)試驗組與對照組之間代謝物的差異，對代謝物進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建熱圖(圖4)。由圖可見，兩組代謝物之間有明顯的區(qū)分。

圖4 對照組和試驗組差異代謝物聚類分析熱圖Fig.4 Cluster analysis of different metabolites in CS group and RSc group

3 討論

腎上腺素是腎上腺髓質(zhì)分泌的主要激素，屬于酪氨酸衍生物[13]。當(dāng)機(jī)體的能量狀態(tài)、營養(yǎng)狀態(tài)發(fā)生改變時，外周感受器便將信號傳遞給大腦[14]，交感神經(jīng)作用于腎上腺促使其分泌腎上腺素。腎上腺素有助于調(diào)動葡萄糖和游離脂肪酸形式的能量儲存，為體力活動或低血糖的恢復(fù)做準(zhǔn)備[15-16]。本研究試驗組奶牛血漿中的腎上腺素水平顯著增加(P<0.05)，這一變化可能是由于奶牛從日糧中獲得的能量不足，腎上腺素分泌增加，激活激素敏感脂肪酶，促進(jìn)脂質(zhì)動員，產(chǎn)生能量以供應(yīng)機(jī)體需求。

β-羥丁酸(BHBA)和非酯化脂肪酸(NEFA)是反映奶牛在組織動員過程中營養(yǎng)狀況和對能量負(fù)平衡適應(yīng)的重要代謝參數(shù)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，高能量日糧能夠顯著提高奶牛產(chǎn)前營養(yǎng)物質(zhì)消化率和能量攝入量，降低母牛產(chǎn)后血清中的β-羥丁酸和非酯化脂肪酸含量[18]。本研究結(jié)果顯示，試驗組奶牛血漿中的β-羥丁酸的含量較對照組顯著增加(P<0.05)，這可能是由于稻草自身能值及動物消化利用率低，供給能量較少，致使奶牛動員自身體脂產(chǎn)生非酯化脂肪酸[19]，通過糖異生增加葡萄糖濃度以維持血糖濃度恒定，而過多的脂肪酸無法全部被氧化分解則縮合形成酮體[20]。肉堿是一種類維生素的水溶性小分子[21]，其主要生理作用是作為載體將胞質(zhì)中的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運進(jìn)入線粒體基質(zhì)進(jìn)行β-氧化，在脂肪分解過程中起重要作用[22-23]。本研究試驗組奶牛血漿中的肉堿含量顯著增加(P<0.05)，進(jìn)一步證明奶牛能量不足，脂肪動員分解增強(qiáng)。

脫氧膽酸和膽酸是膽汁酸的重要組成部分，膽汁酸是膽固醇的主要代謝終產(chǎn)物，是腸道營養(yǎng)吸收和膽汁分泌脂類的重要生理介質(zhì)[24-25]。研究表明，膽汁酸作為信號分子和代謝調(diào)節(jié)劑，激活核受體和G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)信號，在調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)、葡萄糖和能量穩(wěn)態(tài)，維持代謝穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[26]。本結(jié)果顯示，試驗組奶牛血漿中的脫氧膽酸和膽汁酸的含量顯著增加(P<0.05)，這一變化可能是日糧結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致奶牛體內(nèi)的代謝穩(wěn)態(tài)受到影響，肝臟分泌更多的膽汁酸乳化脂肪，促進(jìn)脂肪的水解代謝及吸收，以此來維持機(jī)體能量代謝的穩(wěn)定。

煙酰胺作為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，輔酶Ⅰ)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，輔酶Ⅱ)合成的前體物質(zhì)，在機(jī)體的脂代謝、糖代謝、蛋白質(zhì)代謝等過程發(fā)揮重要作用[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)，以稻草作為日糧的奶牛丙酸產(chǎn)生量較低，肝臟糖異生作用生成的葡萄糖少。本研究結(jié)果顯示，試驗組奶牛血漿中的煙酰胺含量顯著增加(P<0.05)，這可能是由于稻草在奶牛體內(nèi)的降解率和消化率低，丙酸產(chǎn)量減少，使得機(jī)體的糖異生作用增強(qiáng)，需要更多的煙酰胺來合成輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ供給糖異生過程。

機(jī)體內(nèi)存在的谷胱甘肽大多為還原型，主要保護(hù)紅細(xì)胞中含硫醇膜蛋白和酶蛋白的完整性及其正常代謝功能，使紅細(xì)胞免受血液中氧化劑的損傷[29]。本研究顯示，試驗組奶牛血漿中谷胱甘肽含量明顯低于對照組(P<0.05)，可能是由于伴隨脂質(zhì)分解代謝的增強(qiáng)產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物和活性氧[30]。糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇激素，用于調(diào)節(jié)全身代謝穩(wěn)態(tài)，以哺乳動物在應(yīng)激條件下的生存起到至關(guān)重要的作用[31-32]。處于應(yīng)激狀態(tài)時，皮質(zhì)醇能夠激活糖皮質(zhì)激素受體信號通路，增加血漿葡萄糖濃度和肝糖原含量，并且影響細(xì)胞應(yīng)激閾值[33]。本研究表明，試驗組奶牛血漿中皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮含量顯著降低(P<0.05)，因此可推測，稻草替代部分玉米青貯后，機(jī)體沒有產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。

4 小結(jié)

綜上所述，本試驗采用LC-MS/MS技術(shù)分析稻草替代部分玉米青貯后奶牛的血漿代謝產(chǎn)物變化情況。試驗組奶牛血漿中共篩選到41個差異代謝物，其中腎上腺素、β-羥丁酸、肉堿、煙酰胺、脫氧膽酸和膽汁酸等物質(zhì)的含量升高，谷胱甘肽含量降低，表明稻草替代部分玉米青貯后奶牛脂肪動員增強(qiáng)，機(jī)體的糖脂代謝以及抗氧化能力受到了一定程度的影響。