不同時(shí)期應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷后增生性瘢痕形成的影響

邢 亮，馮建科，馬磊磊，魏 偉，張慶富，張 涵

（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院燒傷整形科 河北 石家莊 050000）

瘢痕是皮膚受到各種創(chuàng)傷愈合修復(fù)后的自然反應(yīng)，其異常增生可導(dǎo)致病理性瘢痕。病理性瘢痕可以分為很多種，包括增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)、淺表性瘢痕和瘢痕疙瘩等[1]。在瘢痕的眾多類型里以HS最為常見而又難以治療，約占91.4%[2]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮網(wǎng)層，因此極易發(fā)生異常增生，形成HS，給患者帶來經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，是臨床燒傷科醫(yī)師面臨的一大難題[2]。復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠內(nèi)含洋蔥提取液、肝素鈉和尿囊素，具有抑制成纖維細(xì)胞的增殖、避免組織硬化、抗炎、增加瘢痕表面有彈力、減少病理性膠原過度增生和促進(jìn)細(xì)胞上皮化的作用，常于創(chuàng)面愈合后立即應(yīng)用，臨床治療作用明確，但有研究發(fā)現(xiàn)部分患者治療效果并不理想[3-4]。瘢痕的增生過程可分為炎癥期（肉芽組織期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3個(gè)階段[5]。各個(gè)階段細(xì)胞生長環(huán)境不同，藥物作用效果也因應(yīng)用時(shí)間不同可產(chǎn)生巨大的差異。本研究通過制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，觀察不同時(shí)期應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)HS的影響，以期發(fā)現(xiàn)復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠抑制瘢痕增生的最佳時(shí)間。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇20周齡SPF級(jí)SD大鼠50只，購于河北伊維沃生物科技有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2020-002]，雌雄不限，體重（250±50）g。分籠飼養(yǎng)于室溫18℃～25℃、濕度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗交替和潔凈空氣通風(fēng)的環(huán)境中。定時(shí)喂食和更換墊料。所有的處理嚴(yán)格遵行《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并在醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器：復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠購于Merz Pharma GmbH & Co.KGaA公司、OCT冰凍切片包埋劑、伊紅、蘇木素、改良Masson三色染色試劑盒和中性樹膠均購于索萊寶公司；TRIZOL購于Thermo Scientific公司；FastKing RT Kit和FastFire qPCR PreMix購于天根生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)場地由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽洌篠D大鼠實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。參照丁毅等[6]報(bào)道的方法制備模型：大鼠實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，造模前1 d禁食禁水12 h。使用10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔注射麻醉，背部備皮，完全刮干凈毛發(fā)后用8%硫化鈉溶液脫毛，75%乙醇消毒。將砝碼放到燒開的水浴鍋中，煮沸10 min，用鑷子將砝碼垂直置于大鼠背部要燙傷的皮膚上，持續(xù)10 s后移開砝碼（病理切片觀察是否為深Ⅱ度燙傷），移開砝碼后立即予腹腔注射5 ml生理鹽水，進(jìn)行抗休克治療。病理切片證實(shí)造模成功，切片呈現(xiàn)：部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細(xì)血管擴(kuò)張、管腔可見血液瘀滯及紅細(xì)胞。對(duì)照組大鼠不作任何處理。見圖1。

圖1 兩組創(chuàng)面皮膚病理切片（100×）

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠應(yīng)用時(shí)間分為14 d組（A組）、28 d組（B組）和42 d組（C組）。其中A組又分為應(yīng)用前對(duì)照組（A0組，于造模第14天取材）、未應(yīng)用組（A1組，于造模第14天應(yīng)用凡士林，涂抹28 d后取材）、應(yīng)用組（A2組，于造模第14天應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，與A1組同期取材）。B組又分為應(yīng)用前對(duì)照組（B0組，于造模第28天取材）、未應(yīng)用組（B1組，于造模第28天應(yīng)用凡士林，涂抹28 d后取材）、應(yīng)用組（B2組，于造模第28天應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，與B1組同期取材）。C組又分為應(yīng)用前對(duì)照組（C0組，于造模第42天取材）、未應(yīng)用組（C1組，于造模第42天應(yīng)用凡士林，涂抹28 d后取材）、應(yīng)用組（C2組，于造模第42天應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，與C1組同期取材）。共造模45只，每小組5只。未應(yīng)用組和應(yīng)用組每天固定時(shí)間在創(chuàng)面直徑3 cm范圍內(nèi)均勻涂抹凡士林或復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠3次(各凝膠涂擦量為1.0 g)。

1.3.3 創(chuàng)面愈合率計(jì)算：觀察A組SD大鼠瘢痕組織的質(zhì)地、顏色和上皮化程度，并用相機(jī)拍照。在3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d、35 d 和42 d記錄創(chuàng)面情況，使用Adobe Photoshop CS6和 Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算大鼠的愈合率。愈合率（%）=（S0-S）/S0×100%，其中S0為原始創(chuàng)面面積，S為未愈創(chuàng)面面積。創(chuàng)面完全愈合的標(biāo)準(zhǔn)為創(chuàng)面完全被上皮覆蓋，無殘余缺損，創(chuàng)面色均一光滑。

1.3.4 HE染色：收集各組瘢痕組織放入4%甲醛溶液中固定、脫水，OCT包埋后切成10μm厚的切片。蘇木精染色5 min，伊紅染色3 min，完成操作后將切片在Nikon顯微鏡下拍照，觀察組織形態(tài)。鏡下測量瘢痕組織以及鄰近的正常組織表皮層和真皮層厚度。取5個(gè)視野的平均值。

1.3.5 Masson染色：按照改良Masson三色染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，脫水后用二甲苯透明、封片，完成操作后將切片在Nikon倒置顯微鏡下拍照進(jìn)行分析。觀察各組SD大鼠瘢痕組織膠原纖維的分布與排列。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行分析，測量積分吸光度值和圖像面積，求每個(gè)視野積分吸光度與圖像面積的比值，記為光密度值。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測：取SD大鼠瘢痕組織100 mg置于勻漿器中，加入裂解液進(jìn)行勻漿，提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后進(jìn)行qPCR進(jìn)行檢測。所需引物由上海生工生物有限公司合成。見表1。以GAPDH基因作為內(nèi)參，采用lg2-ΔCT法計(jì)算瘢痕組織中IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)，ΔCT=CT（目的基因）-CT（GAPDH）。

表1 各基因引物序列

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總。GraphPad Prism version 5.0軟件進(jìn)行制圖。SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Spapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。符合正態(tài)且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。不符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用M（P25,P75）表示，兩獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis單因子方差分析，兩兩比較采用Dunnett法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙尾）。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響：燒傷后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d，對(duì)A1組和A2組創(chuàng)面進(jìn)行拍照。見圖2。3 d、7 d和14 d，A1組和A2組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A1組在14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠后，21 d創(chuàng)面愈合率與A2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；28 d、35 d和42 d創(chuàng)面愈合率與A2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝對(duì)創(chuàng)面愈合率有一定影響。見圖3。

圖2 A1組和A2組不同時(shí)間大鼠燒傷創(chuàng)面愈合情況

圖3 A1組和A2組不同時(shí)間大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率比較

2.2 不同時(shí)間應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)瘢痕組織厚度的影響：各組間大鼠創(chuàng)面臨近的正常皮膚組織表皮層和真皮層厚度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。瘢痕組織厚度變化值為未應(yīng)用組和應(yīng)用組與應(yīng)用前對(duì)照組的差值，即未應(yīng)用和應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織厚度的變化量。A2組和B2組瘢痕組織厚度的增長量較A1組和B1組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)未應(yīng)用組和應(yīng)用組瘢痕組織厚度的差值A(chǔ)組、B組均大于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。各組瘢痕組織HE染色結(jié)果見圖5。

表2 未應(yīng)用組與應(yīng)用組瘢痕厚度變化比較 （±s,μm）

表2 未應(yīng)用組與應(yīng)用組瘢痕厚度變化比較 （±s,μm）

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圖4 各組瘢痕組織厚度變化量比較

圖5 各組瘢痕組織HE染色結(jié)果（100×）

2.3 不同時(shí)間應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)瘢痕組織膠原纖維的影響：改良Masson染色瘢痕組織后，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、胞質(zhì)、纖維素、角蛋白和紅細(xì)胞呈紅色，見圖6。膠原纖維光密度變化值為未應(yīng)用和應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織膠原纖維光密度值的變化量。A2組、B2組、C2組瘢痕組織膠原纖維光密度值的增長量分別較A1組、B1組、C1組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)未應(yīng)用組和應(yīng)用組膠原纖維光密度值變化量差值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，A組明顯大于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；A組與B組、B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖7。

圖6 各組瘢痕組織Masson染色結(jié)果（100×）

圖7 各組瘢痕組織膠原纖維光密度值變化量比較

表3 未應(yīng)用組與應(yīng)用組膠原纖維光密度值變化比較 [±s，M（P25,P75）]

表3 未應(yīng)用組與應(yīng)用組膠原纖維光密度值變化比較 [±s，M（P25,P75）]

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2.4 不同時(shí)間應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響：IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)變化值為未應(yīng)用和應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)的變化量。A2組IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)的變化量較A1組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B2組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)的變化量較B1組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B2組與B1組TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)的變化量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；C2組與C1組IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)的變化量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)未應(yīng)用組和應(yīng)用組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)變化量的差值A(chǔ)組最大，B組次之，C組最小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；三個(gè)時(shí)間點(diǎn)未應(yīng)用組和應(yīng)用組TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)變化量的差值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖8。

表4 未應(yīng)用組與應(yīng)用組IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量變化比較 （±s）

表4 未應(yīng)用組與應(yīng)用組IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量變化比較 （±s）

圖8 各組瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)變化量比較

2.5 各組炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和膠原纖維的分布與排列：A1組、B1組和C1組未應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，炎性細(xì)胞明顯增多，成纖維細(xì)胞增生明顯，膠原纖維排列紊亂，結(jié)構(gòu)致密，增生明顯。A2組、B2組和C2組應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠，炎性細(xì)胞相對(duì)較少，成纖維細(xì)胞和膠原纖維增生相對(duì)較少，膠原纖維排布相對(duì)規(guī)則，結(jié)構(gòu)疏松，間隙較寬。見圖5～6。

3 討論

燒傷是日常生活中常見的意外傷害之一，我國每年有超2 000萬人因不同程度的燒傷入院，其中又以深Ⅱ度燒傷最為常見[7]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮網(wǎng)層，因此極易發(fā)生異常增生，形成HS。復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠內(nèi)含洋蔥提取液、肝素鈉和尿囊素，具有抑制成纖維細(xì)胞的增殖、避免組織硬化、抗炎、增加瘢痕表面彈力、減少病理性膠原過度增生和促進(jìn)細(xì)胞上皮化的作用，常于創(chuàng)面愈合后立即應(yīng)用，臨床治療作用明確，但有研究發(fā)現(xiàn)部分患者治療效果不甚理想[3-4]。瘢痕的增生過程可分為炎癥期（肉芽組織期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3個(gè)階段[5]。各個(gè)階段細(xì)胞生長環(huán)境不同，藥物作用效果也因應(yīng)用時(shí)間不同可產(chǎn)生巨大的差異。在炎癥階段，炎癥細(xì)胞可浸潤到傷口位置，清除細(xì)菌和壞死組織，并分泌細(xì)胞因子激活成纖維細(xì)胞的增殖和血管發(fā)生；在增殖階段，創(chuàng)面完全愈合，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量膠原纖維和及其他細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)蛋白；在成熟階段，瘢痕組織重塑，最終成熟。有研究表明，深Ⅱ度燒傷大鼠創(chuàng)面成纖維細(xì)胞在第14天增殖最活躍[8]，在第28天創(chuàng)面基本愈合，開始進(jìn)入增殖階段[9]。這也是本次實(shí)驗(yàn)設(shè)定復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠應(yīng)用時(shí)間的依據(jù)。

復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠作為一種抗HS的藥物，具有抗纖維母細(xì)胞增生和抑制細(xì)胞外基質(zhì)生成的作用[10]。因此，在臨床中復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠在創(chuàng)面愈合后立即使用。本研究發(fā)現(xiàn)，燒傷后第3、7和14天，A1組和A2組創(chuàng)面愈合率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A1組在14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠后，第21天創(chuàng)面愈合率與A2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,第28、35和42天創(chuàng)面愈合率與A2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)創(chuàng)面愈合有一定影響。

增生性瘢痕形成機(jī)制復(fù)雜，主要是由于皮膚過度修復(fù)，即真皮成纖維細(xì)胞為主的細(xì)胞大量增殖及以膠原纖維為主的細(xì)胞外基質(zhì)過度堆積[11]。成纖維細(xì)胞和膠原纖維的排列結(jié)構(gòu)和組成比例的改變可直接影響瘢痕組織的質(zhì)地。在本研究中14 d和28 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠后成纖維細(xì)胞和膠原纖維的表達(dá)減少，最終有效抑制瘢痕增生，且14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠后效果最明顯。大鼠創(chuàng)面在第14天成纖維細(xì)胞增殖最活躍[8]。推測復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠在成纖維細(xì)胞和膠原纖維活躍的初期作用更加明顯。而42 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠僅能抑制膠原纖維的表達(dá)，對(duì)瘢痕組織的厚度無明顯的影響，這可能是增生后期細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，對(duì)藥物反應(yīng)不明顯。

有研究表明，皮膚在損傷后為更好的進(jìn)行修復(fù)，開始啟動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，適度的炎癥反應(yīng)有利于溶解和去除組織碎片，抑制細(xì)菌，防止加重感染，而過度持續(xù)性的慢性炎癥則會(huì)造成創(chuàng)面愈合障礙并刺激成纖維細(xì)胞增殖分裂[12]。皮膚損傷后，在急性炎癥期積極治療，可抑制IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α等炎癥因子的過表達(dá)，進(jìn)而抑制增生性瘢痕的產(chǎn)生和減少創(chuàng)面皮膚的色素沉積[13]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）及其下游Smad家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在增生性瘢痕發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，IL-6 過表達(dá)可誘導(dǎo)Th1細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而激活TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，將急性炎癥轉(zhuǎn)變?yōu)槁匝装Y，促進(jìn)纖維化狀態(tài)，從而導(dǎo)致瘢痕的增生[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠可顯著降低IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)；28 d僅能顯著降低IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)；42 d不能顯著降低IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)。提示在炎癥期應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠的抑炎作用更加明顯，后期由于創(chuàng)面愈合，炎癥因子表達(dá)相對(duì)降低，故復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠抑制炎癥作用降低。

本研究的目的是探討復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠抑制HS的最佳應(yīng)用時(shí)間。在14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠后，與未應(yīng)用組比，僅在21 d瘢痕愈合產(chǎn)生差異，之后無明顯影響，這可能與復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠影響肉芽組織的產(chǎn)生同時(shí)具有抗炎作用，兩者作用效果疊加導(dǎo)致。王茶鋒等[16]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)122例兒童顏面部軟組織挫傷患者于術(shù)后早期應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠預(yù)防瘢痕，并隨訪6個(gè)月～1年，均無明顯瘢痕且外觀及功能的恢復(fù)理效果想。本研究也有相似的結(jié)果，在14 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)抑制瘢痕增生和膠原纖維生成方面明顯較28 d和42 d效果好。目前，復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠應(yīng)用于完全愈合后，這是為防止其抑制創(chuàng)面愈合而引起感染。然而，隨著人們意識(shí)的提高、處理及時(shí)和抗生素的應(yīng)用，燒傷創(chuàng)面感染的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。提示，深Ⅱ度燒傷早期應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠對(duì)抑制瘢痕增生效果會(huì)更加明顯且不易發(fā)生感染。

綜上所述，深Ⅱ度燒傷后14 d、28 d和42 d應(yīng)用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠均可一定程度抑制大鼠瘢痕的增生，抑制膠原纖維和炎癥因子基因的表達(dá)，其中14 d應(yīng)用效果最佳。為臨床更好的使用復(fù)方肝素鈉尿囊素凝膠治療HS提供了理論依據(jù)。