天然甜味劑羅漢果甜苷的研究進展

戴 勝，汪惠麗

（1.安徽中醫(yī)藥高等專科學校，安徽 蕪湖 240001； 2.合肥工業(yè)大學，安徽 合肥 230009）

羅漢果Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey 是一種葫蘆科多年生藤本植物的果實，主產(chǎn)于廣西，是我國特有的經(jīng)濟和藥用植物［1］。羅漢果性涼味甘，作為傳統(tǒng)藥材在民間使用已經(jīng)有三百多年的歷史，具有清熱潤肺、利咽開音、滑腸通便的功效［2-3］。

目前，從羅漢果中已分離得到一百多個化合物，包括46 個三萜、7 個黃酮、19 個氨基酸、2 個多糖等［4］。羅漢果甜苷是羅漢果的主要活性成分，它是一種葫蘆烷三萜苷類化合物，又名羅漢果提取物、羅漢果甜苷、羅漢果皂苷等［5］。同時，羅漢果甜苷也是羅漢果甜味的主要成分。1975 年，Lee［6］研究確定葫蘆烷三萜糖苷是甜味的主要成分。1983 年，首次從羅漢果中分離得到羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、羅漢果甜苷Ⅵ，此后相繼從羅漢果中分離到三十余個類似化合物［7-8］。這些化合物都以羅漢果醇為苷元，接有不同數(shù)目的糖基，見圖1。天然甜味劑羅漢果甜苷甜度高、熱量低，相比于人工甜味劑后苦味少、安全性好，還具有降血糖作用，是蔗糖的理想替代品?，F(xiàn)已被美國、日本、澳大利亞、新西蘭等多國列入食品添加劑名單［5］。本文對羅漢果甜苷的甜味構(gòu)效關(guān)系、周期性變化、生物合成途徑、降糖作用及其他生物活性、安全性進行綜述，以期為羅漢果甜苷作為天然甜味劑的應用提供進一步參考。

圖1 羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)

1 甜味構(gòu)效關(guān)系

羅漢果甜苷按羅漢果醇上葡萄糖基的連接位置、數(shù)目及方式不同命名為羅漢果甜苷Ⅲ、羅漢果甜苷ⅢE、羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ、羅漢果新苷、賽門苷Ⅰ等，其中以羅漢果甜苷Ⅴ含量最高［9］，見表1。Murata 等［10］進行感官測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅲ、羅漢果甜苷Ⅳ、羅漢果甜苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ分別相當于蔗糖甜度的195、300、378、465、68 倍。從結(jié)構(gòu)上來看，羅漢果甜苷是以羅漢果醇為苷元，在C-3、C-24 位上通過苷鍵連有葡萄糖基，其甜味與結(jié)構(gòu)的關(guān)系為①糖基數(shù)目，要保持甜味，C-3、C-24 位上所接糖基總數(shù)目不得少于3 個；②11 位取代基的氧化狀態(tài)，11 位羥基如果是α 構(gòu)型為甜味；如果是β 構(gòu)型為無味，11 位羥基如果被氧化則為苦味［11-13］。此外，賽門苷Ⅰ雖然只連有4個糖基，但是它的甜度卻遠高于同樣含有4 個糖基的羅漢果甜苷Ⅳ。因而結(jié)構(gòu)中糖基連接位置對羅漢果甜苷甜味的影響也值得進一步研究。常見羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)信息見表1。

表1 常見羅漢果甜苷結(jié)構(gòu)信息

2 周期性變化及生物合成

成熟的羅漢果果實是甜味的，然而其幼果卻是苦味的，提示羅漢果果實中苷類成分的含量在生長過程中發(fā)生變化。Murata 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，成熟的羅漢果中甜味苷含量高于未成熟的羅漢果。李典鵬等［14］采用薄層色譜法研究不同生長日齡羅漢果苷類成分變化，發(fā)現(xiàn)生長日齡小于30 d的幼果主要含有苦味的羅漢果甜苷ⅡE；羅漢果甜苷Ⅲ在30 d 后開始出現(xiàn)，并在55 d 時含量達到高峰，并有羅漢果甜苷Ⅳ生成，羅漢果甜苷Ⅳ含量在70 d 達到最高；85 d 以后，羅漢果甜苷Ⅴ為羅漢果的主要甜味成分。盧鳳來等［15］通過RP-HPLC 法研究不同生長時期羅漢果，發(fā)現(xiàn)10 d 時羅漢果內(nèi)苦味苷（羅漢果甜苷ⅡE、11-O-羅漢果甜苷ⅡE）含量最高；55 d 以后則以甜味苷羅漢果甜苷Ⅴ為主；65 d 以后羅漢果甜苷Ⅴ含量變化不大。除羅漢果甜苷Ⅴ外，所有苷類含量變化都呈現(xiàn)出先增長后降低的趨勢。另有文獻報道，植物中三萜皂苷的生物合成中低聚糖鏈很可能是按順序?qū)翁欠肿蛹拥杰赵虾铣傻模?6］，提示羅漢果苷在生長周期中由苦味的低糖苷向甜味的高糖苷進行單一方向的轉(zhuǎn)變。

Itkin 等［17］根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)，完整解析羅漢果甜苷Ⅴ在羅漢果果實內(nèi)的生物合成途徑，其在果實內(nèi)的生物合成基本可以分為2 個步驟，即羅漢果醇的形成和糖基化。首先是羅漢果醇的生成，乙酰輔酶A 經(jīng)甲羥戊酸途徑生成角鯊烯，角鯊烯在角鯊烯環(huán)氧化酶、葫蘆二烯醇合成酶、環(huán)氧水解酶的依次作用下生成24，25-二羥基葫蘆二烯醇，在CYP87D18 作用下羥基化生成羅漢果醇。而在接下來的糖基化過程中，羅漢果醇先是在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT720-269-1 的作用下生成苦味苷（羅漢果甜苷ⅠA1、羅漢果甜苷ⅡE）。羅漢果甜苷ⅡE 在糖基轉(zhuǎn)移酶UGT94-289-3 的作用下糖基化形成甜味苷羅漢果甜苷ⅢX、羅漢果甜苷ⅣA、賽門苷Ⅰ，最后生成羅漢果甜苷Ⅴ，生物合成途徑見圖2。而在該生物合成途徑中影響糖基化作用的關(guān)鍵酶UGT720-269-1、UGT94-289-3 表達具有時間差異性。UGT720-269-1在幼果中高度表達，隨著果實成熟而下降。而UGT94 酶家族則是在發(fā)育后期表達升高。這與之前幼果中主要成分為羅漢果甜苷ⅡE 等低糖苷，在果實發(fā)育后期高糖苷不斷增加，最后羅漢果甜苷Ⅴ成為成熟果實中主要成分的報道相一致。

圖2 羅漢果甜苷Ⅴ生物合成途徑

綜上所述，羅漢果一般要等到65 d 以后果實開始成熟的時候進行采摘，在加工過程中不得將未成熟和成熟水果的提取物混合使用，否則都會降低其中羅漢果甜苷的含量從而影響提取物的質(zhì)量。

3 降糖作用

研究表明，羅漢果甜苷不僅對控制血糖有效，還能預防糖尿病相關(guān)的慢性并發(fā)癥，其降糖機制可分為修復胰腺損傷，促進胰島素分泌，改善胰島素抵抗，抗氧化應激，抑制α-葡萄糖苷酶活性。

3.1 修復胰腺損傷，促進胰島素分泌 四氧嘧啶可以通過產(chǎn)生自由基、抑制葡萄糖激酶等作用損害胰島β 細胞，抑制胰島素原合成，引起1 型糖尿病［18］。張俐勤等［19］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷提取物可以通過減弱四氧嘧啶對胰島β 細胞的損傷或改善受損傷細胞的功能來達到降糖目的，其主要活性成分可能為羅漢果甜苷。Qi 等［20］研究表明，羅漢果甜苷提取物可以有效改善糖尿病小鼠胰島細胞形態(tài)，增加胰島細胞數(shù)量，減輕四氧嘧啶所致小鼠胰島β 細胞損傷，改善代謝紊亂。周英等［21］以大鼠胰島β 細胞瘤細胞RIN-5F為研究對象，發(fā)現(xiàn)羅漢果提取物和羅漢果甜苷Ⅴ可以促進胰島素的分泌。

3.2 改善胰島素抵抗 胰島素抵抗是指胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降，是2 型糖尿病的主要病理特征，降低胰島素抵抗可以延緩糖尿病并發(fā)癥的進展。Liu 等［22］用鏈脲佐菌素（STZ）聯(lián)合高脂飲食誘導C57BL／6 小鼠構(gòu)建2 型糖尿病模型，研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷提取物可以改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗，表現(xiàn)為胰島素抵抗指數(shù)降低，胰島素敏感性指數(shù)升高。另有研究報道，通過TLR4 途徑激活c-Jun N 末端激酶（TLR4-JNK）和氧化應激都可以介導胰島素抵抗［23-24］，羅漢果甜苷ⅢE 可以阻斷TLR4-JNK 信號通路［25］。

3.3 抗氧化應激 氧化應激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，產(chǎn)生大量活性氧（ROS）損傷機體組織細胞及蛋白等生物大分子。ROS 在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中除了能誘發(fā)胰島素抵抗外，還能直接損傷胰島β 細胞，最終引發(fā)或加重糖尿?。?4］。朱慧玲等［26］研究表明，羅漢果皂苷預處理可以減少乙醇損傷L-02 細胞活性氧和自由基的過量積累，降低氧化應激，抑制脂質(zhì)過氧化。鄒健等［27］對羅漢果皂苷粗提物的抗氧化活性進行研究，發(fā)現(xiàn)其具有較好的清除自由基（DPPH、ABTS、ORAC）、鐵離子還原（FRAP）、抗油脂氧化的能力，且抗氧化能力隨著濃度的增加而增加。Chen 等［28］研究羅漢果甜苷體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其對氧自由基（O2－、H2O2、·OH）和DNA 氧化損傷具有抑制作用，其中羅漢果甜苷Ⅴ對清除·OH 更加有效，而11-O-羅漢果甜苷Ⅴ對O2－、H2O2具有更高的清除率。此外，11-O-羅漢果甜苷Ⅴ對·OH 誘導的DNA 損傷具有抑制作用。張俐勤等［19］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果皂苷提取物在體內(nèi)可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化物（MDA）的生成，提高其抗氧化酶系統(tǒng)SOD、GSH-Px 活性。

3.4 抑制α-葡萄糖苷酶活性 α-葡萄糖苷酶的主要功能為水解葡萄糖苷鍵，釋放出葡萄糖。抑制小腸黏膜α-葡萄糖苷酶活性可以減慢糖類水解及產(chǎn)生葡萄糖的速率并延緩葡萄糖的吸收從而降低餐后血糖，該方法對2 型糖尿病的防治具有重要作用［29］。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長期羅漢果提取物對小鼠餐后血糖生成均有抑制效果，其降糖作用機制之一是羅漢果皂苷提取物能直接抑制α-葡萄糖苷酶活性，其抑制作用與劑量呈正相關(guān)［30-31］。

3.5 其他 研究表明，羅漢果皂苷提取物激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）可能有助于抑制糖尿病小鼠糖異生從而達到降低血糖目的［22］。另有研究報道，羅漢果皂苷提取物可以降低細胞因子IFN-γ、TNF-α 水平，同時升高細胞因子IL-4 水平，從而改善糖尿病小鼠的細胞免疫失衡達到控制糖尿病的目的［20］。此外，羅漢果皂苷提取物可以通過提高糖尿病小鼠血清高密度脂蛋白水平，使血脂水平趨向正常，防止糖尿病引起的脂類代謝紊亂，對糖尿病并發(fā)癥有防治作用［19］。

綜上所述，羅漢果甜苷不僅對1 型和2 型糖尿病都有很好的防治效果，還能有效預防糖尿病相關(guān)的并發(fā)癥。此外，羅漢果中黃酮、多糖、多酚類成分也具有降血糖的活性［32］。

4 其他藥理作用

4.1 止咳祛痰平喘 陳瑤等［33］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷可以降低小鼠的咳嗽次數(shù)，促進氣管分泌物產(chǎn)生。劉婷等［34］對羅漢果鎮(zhèn)咳祛痰的有效成分進行篩選，推測羅漢果甜苷Ⅴ為羅漢果鎮(zhèn)咳的主要活性成分。王勤等［35］建立羅漢果祛痰的譜效關(guān)系模型，結(jié)果表明，羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ與祛痰作用呈正相關(guān)且貢獻較大。Song 等［36］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅴ能有效抑制卵清蛋白誘導的氣道高反應性。

4.2 保肝作用 肖剛等［37］運用四氯化碳和卡介苗加脂多糖分別誘導構(gòu)建小鼠急性肝損傷和免疫性肝損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷能降低2 種肝損傷模型小鼠血清ALT、AST 活性，升高免疫性肝損傷的肝組織勻漿SOD 活性，降低MDA 水平，并能改善肝組織病理損傷。肝星狀細胞HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此誘導活化的HSC 細胞凋亡是防治纖維化的有效手段［38］。研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷含藥血清對大鼠肝星狀細胞HSC-T6 周期具有阻滯作用，能誘導其發(fā)生凋亡［39-40］。宋開娟等［41］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷在體外可以抑制人肝星狀細胞LX-2 活化，并能促進肝星狀細胞凋亡。

4.3 抗癌 在胰腺癌的體外和體內(nèi)模型中，羅漢果甜苷Ⅴ通過促進胰腺癌細胞PANC-1 凋亡和細胞周期阻滯，從而抑制腫瘤生長的活性［42］。羅漢果甜苷ⅣE 劑量依賴性地抑制人結(jié)腸癌細胞HT29、人喉表皮樣癌細胞Hep-2 增殖和異種移植腫瘤小鼠模型的腫瘤生長［43］。通過小鼠體內(nèi)皮膚癌變實驗發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷Ⅴ、11-O-羅漢果甜苷Ⅴ可以有效抑制以過氧亞硝酸鹽為誘變致癌劑、苯二甲酸作為腫瘤促進劑的兩步致癌過程。而11-O-羅漢果甜苷Ⅴ在以7，12-二甲基苯并［a］蒽作為誘變致癌劑，苯二甲酸作為腫瘤促進劑的兩步致癌過程也同樣表現(xiàn)出抑制作用［44］。

4.4 抗炎抑菌 Di 等［45］研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果甜苷可以通過降低炎性關(guān)鍵基因iNOS、COX-2、IL-6 表達，升高炎癥保護基因PARP1、BCL2l1、TRP53、MAPK9 表 達，抑 制RAW264.7 細胞內(nèi)脂多糖誘導的炎癥反應。同樣，在小鼠耳腫脹模型中，羅漢果甜苷可以通過降低COX-2、IL-6 表達，升高PARP1、BCL2l1、TRP53、MAPK9、PPARδ 表達，抑制12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯誘導的炎癥反應。何怡［46］對黔產(chǎn)羅漢果進行抗炎抑菌譜效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)11-O-羅漢果甜苷Ⅴ既是羅漢果體內(nèi)抗炎活性主要藥效成分，也是羅漢果對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制作用主要藥效成分之一。羅漢果甜苷Ⅴ是羅漢果對糞腸球菌、大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用主要藥效物質(zhì)。

羅漢果甜苷的其他藥理作用見表2。

表2 羅漢果甜苷的藥理作用

5 安全性

蘇小建等［47］研究表明，羅漢果甜苷（甜苷含量為81.6%）灌胃對小鼠的LD50值大于10 000 mg／kg，屬實際無毒級。灌胃給予家犬羅漢果甜苷3.0 g／kg（相當于人用量的360 倍）4 周，家犬的生化指標以及組織器官的形態(tài)學變化均無明顯的影響。Jin 等［48］對Wistar 大鼠進行重復劑量亞慢性毒性研究，發(fā)現(xiàn)羅漢果甜苷各劑量組大鼠在13 周內(nèi)均未見死亡且機體各項指標正常。由此推測，人的不良反應水平男性為每天2 520 mg／kg，女性為每天3 200 mg／kg或更高。另有研究指出，灌胃給予小鼠羅漢果甜苷0.25、0.5、1 g／kg 無生殖與遺傳毒性，但當灌胃劑量達到5 g／kg時，雄性小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率與精子畸形率高于陰性對照組（P＜0.05）［49］。因此，羅漢果甜苷是否具有遺傳毒性還有待進一步的研究，其使用劑量也需要得到關(guān)注。

6 結(jié)語

隨著人們生活水平的提高，糖尿病、肥胖等代謝性疾病已成為人類身體健康的重要威脅，因而高甜度、低熱量的人工甜味劑被廣泛應用于食品領(lǐng)域替代蔗糖。但近年來，隨著人工甜味劑的普及，其安全性備受質(zhì)疑［50］。有研究報道，人工甜味劑的攝入會導致人們對糖的渴望和依賴，熱量補償受損導致食欲刺激，攝入增加，體重增加和葡萄糖不耐受［51-53］。宋曉婉［54］研究證實，天然甜味劑羅漢果甜苷在改善系統(tǒng)性糖耐受和胰島素敏感性方面的效果要顯著優(yōu)于人造甜味劑阿斯巴甜。另外在口感上，人工甜味劑會產(chǎn)生令人不快的后苦味。羅漢果甜苷提取物的苦味與糖精和安賽蜜相比較少［10］。綜合考慮，植物來源的天然甜味劑羅漢果甜苷甜度高、熱量低、安全性好、后苦味少，是蔗糖的理想替代品。此外，羅漢果甜苷還具有降血糖、止咳祛痰平喘、保肝等多種功效，因此，對其進行甜味劑、保健品和藥品的開發(fā)對于促進公眾健康具有重要意義。

目前羅漢果甜苷已在乳品飲料、固體飲料等食品行業(yè)中得到應用，但仍然面臨幾方面的問題，①由于不加選擇進行人工授粉等原因，目前羅漢果推廣應用的品種種類繁多，種質(zhì)總體質(zhì)量不夠理想，仍有較大的遺傳改良空間［55］；②羅漢果甜苷的種類和含量在生長過程中存在周期性變化，因而需要確定一種可以定量測定羅漢果甜苷的方法來加強質(zhì)量控制；③目前羅漢果甜苷的相對甜度測定還是需要經(jīng)過專業(yè)培訓的評定人員進行感官評價，電子舌無法替代［56］，其評測流程復雜，結(jié)果存在一定的主觀性；④羅漢果甜苷提取成本高，價格貴，因此深入了解羅漢果甜苷的生物合成機制，利用細胞工廠生產(chǎn)羅漢果甜苷是量產(chǎn)羅漢果甜苷的潛在途徑之一；⑤羅漢果甜苷作為藥品的屬性有待開發(fā)，其成分復雜，具體藥效成分的研究有待進一步深入，以促使藥品和保健品的開發(fā)。