三種檢測方法在翠屏區(qū)牛結(jié)核病檢疫中的應用

潘延樂，陳銘，王穎旺

（1.宜賓市翠屏區(qū)動物疫病預防控制中心 四川宜賓 644000；2.河南省信陽市動物疫病預防控制中心 河南信陽 464000）

牛結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染病，其病原菌可以廣泛傳播于人與牛之間，是重要的人畜共患病之一。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）把該病列為B 類傳染病，我國將其列為二類動物疫病[1]。該病是目前牛的重要傳染病之一，嚴重危害奶牛養(yǎng)殖。感染譜較廣，其中奶牛最易感，黃牛和耗牛次之，豬、鹿、猴、人均可感染。牛結(jié)核病根據(jù)感染靶器官的不同分為腸結(jié)核、肺結(jié)核、淋巴結(jié)核和乳腺結(jié)核四類，不同類型的結(jié)核病有不同的危害。其主要病理特征為各種組織器官出現(xiàn)肉芽腫脹、嚴重時出現(xiàn)干酪樣壞死，甚至鈣化。結(jié)核分枝桿菌根據(jù)病原菌的不同分為牛型、人型和禽型，且不同類型對靶動物的親近性較強，而各種類型之間存在交叉感染。

在我國，牛結(jié)核病對奶牛養(yǎng)殖場的感染率較高，感染區(qū)域范圍廣，在我國大部分地區(qū)均有本病的報道[2]。發(fā)病無明顯季節(jié)性，常年可發(fā)病，尤其是氣候干燥、氣溫寒冷的冬天高發(fā)。牛結(jié)核分支桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，一般的抗生素對其無效，奶牛一旦感染，即使不發(fā)病也會終身帶毒。這給奶農(nóng)帶來困擾，結(jié)核病能通過水源、飼料、空氣、塵埃、痰液等直接或間接傳播，也可以通過皮膚、唾液、注射器、刀具等接觸傳播，傳播方式多樣性給牛結(jié)核病凈化帶來很多現(xiàn)實困難。

牛結(jié)核病的診斷主要依據(jù)臨床癥狀和流行病學特點來初步診斷，加以實驗室確診。實驗室檢測技術主要包括細菌分離鑒定、免疫學方法和分子生物學方法等[3]。這些檢測方法各有優(yōu)缺點，在牛結(jié)核病檢疫和凈化過程中需要根據(jù)實際情況選擇合適的檢測方法進行檢測。

國外常用皮內(nèi)變態(tài)反應和γ-干擾素體外釋放試驗進行檢疫[4]，1990 年Wood 等[5]通過檢測牛結(jié)核菌素刺激牛全血釋放的γ-干擾素，闡明了診斷牛結(jié)核病的ELISA 方法。γ-干擾素（interferon gamma，IFN-γ）是活化的T 淋巴細胞和NK 細胞在特定抗原和絲裂原的刺激下產(chǎn)生的廣譜抗腫瘤、抗病毒、抑制細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)糖蛋白。γ-干擾素ELISA 試驗和皮內(nèi)變態(tài)反應是國家標準GB/T 18645—2020 中規(guī)定的牛結(jié)核病檢測方法[6]，也是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的國際貿(mào)易制定使用的檢測方法，翠屏區(qū)對轄區(qū)內(nèi)的57 頭奶牛分別用皮內(nèi)變態(tài)反應試驗、膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗進行了比對試驗。

1 牛結(jié)核分枝桿菌皮內(nèi)變態(tài)反應試驗

1.1 試驗材料

翠屏區(qū)轄區(qū)內(nèi)的181 頭奶牛信息見表1，本文中的奶牛養(yǎng)殖戶用字母代替；提純牛型結(jié)核菌素凍干粉PPD（BoPPD）購自中牧實業(yè)有限公司，批號為1908001，使用前按照說明書要求稀釋；碘伏、注射器、刮毛刀、游標卡尺、保定繩等。

表1 翠屏區(qū)2022年牛結(jié)核病普查養(yǎng)殖戶存欄量信息表

1.2 試驗方法

在牛頸側(cè)身中部偏上1/3 處將毛剃干凈，直徑約為10cm，用游標卡尺測量術部中央皮皺厚度，此為原始皮厚，做好原始記錄。術部消毒后，注射稀釋好的牛PDD 0.1mL；注射后局部會出現(xiàn)小皰；72h 后仔細觀察局部有無腫脹、熱痛等炎性反應，用游標卡尺測量皮皺厚度作為反應皮厚，并做好記錄。

1.3 結(jié)果判定

計算出每頭牛的皮厚差（皮厚差=反應后皮厚-初始皮厚）。陰性反應：皮厚差小于2.0mm，無炎性反應；陽性反應：皮厚差大于或等于4.0mm，局部有炎癥反應；可疑反應：皮厚差大于或等于2.0mm但小于4.0mm，局部炎性反應不明顯。

2 牛結(jié)核分枝桿菌γ-干擾素ELISA 試驗

2.1 試驗材料及儀器設備

用含有肝素鈉的真空采血管進行無菌采血，采集上述牛全血樣品每頭約5mL，共57 份；牛結(jié)核病γ-干擾素ELISA 檢測試劑盒，來源于武漢科前生物股份有限公司，試劑批號為20 220301；移液器、U形離心管、生物安全柜、37°C 恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀、洗板機等。

2.2 試驗方法

1）全血采集及預處理?？鼓柙?h 內(nèi)送到實驗室，避免冷凍。并對血樣編號，將試管緩慢顛倒充分混勻血液樣品進行分裝。在無菌條件下將抗凝血分別加入U 形離心管，每份血樣加3 孔，500μL/孔。

2）加入刺激抗原。在無菌條件下分別向相應的U 型管中加入100μL PBS、100μL 牛PPD、100μL 禽PPD，為保證抗原與血液充分混合，在微量振蕩器上輕微振蕩1min 左右。將U 形管置于37°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24h。

3）收取上清液。孵育結(jié)束，將U 形離心管置于離心機中，2,000rpm離心5min，之后用移液器從每孔吸取約100μL 上清液轉(zhuǎn)入96 孔包被板中。

4）牛γ-干擾素ELISA 試驗。將其他相關試劑進行室溫平衡。按照樣本布局表加入獲取的上清樣本100μL/孔；同時設陰性對照和陽性對照各2 孔，37℃孵育45min。洗滌：倒掉孔內(nèi)液體，每孔加入300μL 工作濃度的洗滌液，重復洗滌4 次，最后一次在吸水材料上拍干。加入酶標結(jié)合物：每孔加入100μL 兔抗牛γ-干擾素多克隆抗體，37℃孵育30min。洗滌：如上洗滌4 次。加入底物：每孔依次加入50μL 底物A 溶液和50μL 底物B 溶液，震蕩混勻，于室溫（20～25℃）下避光顯色10min。加入終止液：每孔加入50μL 終止液，輕輕震蕩混勻，10min 內(nèi)在酶標儀上測量各孔OD630nm值。

5）結(jié)果判定：陽性對照OD630nm平均值≥0.5，陰性對照OD630nm＜0.3，試驗成立。計算各樣品的OD 值，陽性：牛PPD 的OD 值-禽PPD 的OD 值≥0.2 且禽PPD 的OD 值-陰性抗原OD 值≥0.2，其他情形均判為牛結(jié)核病陰性。

3 膠體金檢測方法

3.1 試驗材料及方法

布魯氏菌抗體快速檢測卡來源于上海快靈生物科技有限公司，批號為G220601310，全血樣品為步驟2 中的抗凝全血。吸管吸取全血，將1 滴全血樣品滴入稀釋管中，輕輕吸混勻，用吸管吸取檢測液，在加樣孔上方垂直滴加2 滴。45s 內(nèi)測試窗口無液體移行，需追加1 滴檢測液。室溫條件下靜置5min 觀察結(jié)果，超出10min的結(jié)果無效。

3.2 判定標準

在檢測試紙條上C 線和T 線均出現(xiàn)色帶為布魯氏菌抗體陰性，試紙條上C 線顯示紅色顏色條帶，為布魯氏菌抗體陽性，在檢測試紙條上C 線不顯示色帶，無論T 線是否顯示紅色色帶，均判為無效結(jié)果。

4 試驗結(jié)果

4.1 檢測陽性率的比較分析

用皮內(nèi)變態(tài)反應試驗對57 頭奶牛進行檢測，出現(xiàn)8 頭陽性奶牛，個體陽性率為14.03%（8/57），對57 頭奶牛全血進行刺激培養(yǎng)和γ-干擾素ELISA 試驗進行檢測，結(jié)果顯示γ-干擾素ELISA 方法檢出陽性樣品1 份，陽性率為1.75%（1/57），膠體金快速檢測卡試驗陽性率為29.82%，見表2。

表2 不同方法檢測陽性率統(tǒng)計結(jié)果

4.2 皮內(nèi)變態(tài)反應與γ-干擾素ELISA 檢測方法比較結(jié)果

對57 份樣品用γ-干擾素ELISA 檢測與皮內(nèi)變態(tài)反應方法進行比對，結(jié)果表明：皮內(nèi)變態(tài)反應試驗檢出陽性8 頭，γ-干擾素ELISA 方法檢出陽性1 頭，兩種方法檢出的雙陽性牛為1 頭，雙陰性牛為49 頭，兩者之間的敏感性為100%（1/1），特異性為87.5%（49/57），符合率為87.72%（50/57）（表3）。

表3 皮內(nèi)變態(tài)反應與γ-干擾素ELISA方法檢測比較結(jié)果

4.3 三種不同的方法結(jié)果的比較

用三種不同的方法對翠屏區(qū)57 頭奶牛進行牛結(jié)核病檢測，結(jié)果如表4，用皮內(nèi)變態(tài)反應對57 頭奶牛進行初篩，對檢測陽性和可疑奶牛經(jīng)過膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗復檢，確診1 頭牛為結(jié)核病陽性牛。

表4 三種方法牛結(jié)核病檢測結(jié)果

根據(jù)表中結(jié)果統(tǒng)計，三種方法均為陽性的有1 頭，均為陰性的有42 頭，總符合率為75.44%（43/57）。γ-干擾素ELISA 方法與PPD相比，牛結(jié)核菌素均為陽性的為1 頭，陽性符合率為12.5%（1/8）。膠體金檢測與PPD 相比，均為陽性的6 頭，陽性符合率為75%（6/8），陰性符合率為83.67%（41/49），說明膠體金檢測方法特異性較強，可以用于引種時的快速檢疫。γ-干擾素ELISA 方法與膠體金檢測相比，均為陽性的1 頭，陽性符合率為16.67%（1/6）。

5 討論

5.1 牛結(jié)核分枝桿菌皮內(nèi)變態(tài)反應試驗

181 頭牛中對57 頭奶牛進行了皮內(nèi)變態(tài)反應試驗，這并不排除181 頭奶牛中剩余的124 頭奶牛沒有牛型結(jié)核分枝桿菌或禽型結(jié)核分枝桿菌或兩者兼而有之的可能性，早期感染結(jié)核病的奶牛在3～6 周后才能出現(xiàn)變態(tài)反應，這可能會導致皮內(nèi)變態(tài)結(jié)果是陰性或可疑結(jié)果[7]；也可能遲發(fā)型超敏反應對慢性感染動物的敏感性低，結(jié)核菌素試驗會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。因此，上述牛并不能完全排除早期感染或慢性感染的可能性，僅依靠結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應試驗來根除牛群中的結(jié)核病是不科學的。

5.2 膠體金快速檢測卡

膠體金快速檢測卡是檢測感染牛血清或血漿中結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的抗體，從而顯示出視覺可判定的結(jié)果。這種方法操作簡便，敏感性和特異性高，時效性強，適合基層檢疫工作使用，但缺點是試劑盒較貴，檢測成本高。

5.3 γ-干擾素ELISA 抗體試驗

三種方法均為評價細胞免疫功能的試驗[8]，通過不同型的PPD刺激紅細胞產(chǎn)生γ-干擾素進行判定，可以排除禽分枝軒菌對牛引起的非特異性反應。本試驗中皮內(nèi)變態(tài)反應試驗陽性檢出率高于膠體金快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 試驗，很可能與結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應存在假陽性有關。

5.4 γ-干擾素ELISA 試驗相對優(yōu)勢

牛PPD 試驗在實際操作過程中，存在許多不確定性和主觀因素，結(jié)果判定不易標準化，比較繁瑣費時，需要術后72h 才能觀察結(jié)果，導致在診斷過程中出現(xiàn)系統(tǒng)性誤差的可能性較大，但其價格最低、操作簡便，適用于大規(guī)模的監(jiān)測。γ-干擾素ELISA 試驗只需保定一次動物，省時省力，可檢測出早期感染結(jié)核病的牛，并且判定標準為可量化的數(shù)據(jù)，實驗結(jié)果科學客觀。同時，γ-干擾素ELISA 試驗還克服了結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應容易出現(xiàn)假陽性和假陰性的不足，提高了試驗的特異性[9]。

目前，國外許多國家如英國、歐盟等，在牛結(jié)核病防治計劃中使用γ-干擾素試驗增強特異性，兩種試驗并行進行，可增強敏感性，最大程度檢測感染動物，消除假陽性牛，現(xiàn)正被農(nóng)業(yè)部確定為牛結(jié)核病監(jiān)測工作中的可靠方法，具有廣闊的應用前景。

6 結(jié)論

精準的診斷出感染牛結(jié)核分枝桿菌，對牛結(jié)核病的控制和凈化至關重要。從本試驗的結(jié)果來看，若單獨使用皮內(nèi)變態(tài)反應檢出的PDD 陽性牛就進行撲殺，必然造成假陽性牛被誤殺，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失。

隨著人類社會的發(fā)展，人們對奶制品的安全要求越來越高，在引進奶牛的同時也容易把疫病帶入，帶病牛持續(xù)排毒，污染環(huán)境，感染健康的奶牛，造成惡性循環(huán)，針對這種情況，翠屏區(qū)在2000 年左右就開始牛結(jié)核病監(jiān)測，并且對每年檢出的陽性牛進行了無害化處理，持續(xù)不斷地監(jiān)測，讓翠屏區(qū)的奶牛結(jié)核病處于相對安全的狀態(tài)，但以往的監(jiān)測復查均采用的是牛型結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應方法，假陽性和假陰性檢出率較高，本次試驗在省級有關部門的指導下做了皮內(nèi)變態(tài)反應、快速檢測卡和γ-干擾素ELISA 抗體對比試驗。通過本試驗，認為牛結(jié)核菌素試驗適合大規(guī)模初篩，快速檢測卡適用于引種快速檢疫，而要進一步確診還需要用γ-干擾素ELISA 抗體檢測方法。

要想徹底凈化奶牛結(jié)核病，須得做到以下幾點：①嚴懲非法引種，對非法從疫區(qū)引種的人員進行嚴懲；②嚴格落實引進檢疫政策，禁止引進免疫區(qū)和有疫病史的牛，強化落地檢疫政策，倡導自繁自養(yǎng)；③定期開展結(jié)核病篩查，對監(jiān)測陽性牛，立即組織撲殺，并且按照《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》做無害化處理；④養(yǎng)殖場（戶）要嚴格實施生物安全措施，防止外界致病菌進入到養(yǎng)殖場，對從外部引入的牛，要嚴格做好隔離檢疫工作。