雞毒支原體和滑液囊支原體四重PCR 檢測方法的建立

劉洋洋，白紅英，胡思順，畢丁仁，李自力，周祖濤

（1.廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學院動物科學系 廣東茂名 525000；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點實驗室 武漢 430070）

雞毒支原體（mycoplasma gallisepticum，MG）主要引起雞的慢性呼吸道疾病，導致感染雞群出現(xiàn)咳嗽、啰音等癥狀，造成肉雞胴體品質(zhì)下降，種雞產(chǎn)蛋率、受精率和孵化率下降等，發(fā)病后非常容易引起與大腸桿菌的繼發(fā)感染，從而使死亡率上升，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失[1]。在我國禽類養(yǎng)殖場中MG 的感染率很高。滑液囊支原體病是禽的一種急性或慢性傳染病，主要感染雞和火雞，鴨、鵝、珍珠雞等也具有易感性[2]。主要導致關節(jié)腫大、跛行、采食量下降、咳嗽、打噴嚏及胴體品質(zhì)下降等[3]，給全世界的養(yǎng)禽企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

王傳禹等[4]對云南省72 個規(guī)?；B(yǎng)禽場474 份病例進行檢測，結果顯示家禽細菌病占比62.87%，其中支原體發(fā)病比例為10.76%。姜蘭蘭等[5]對北京地區(qū)127 個養(yǎng)雞場、3,910 份血清進行ELISA 抗體檢測，結果顯示MG 和MS 的平均場群陽性率為89.0%和86.6%。MG 和MS 既可水平傳播，也可經(jīng)種蛋垂直傳播[6,7]，給該病的防控及凈化帶來了極大的困難。

目前，防治MG 的最有效辦法就是應用弱毒疫苗株F 株或油乳佐劑疫苗進行預防接種，但弱毒疫苗株F 株疫苗會終生存在于免疫雞群的上呼吸道，干擾臨床樣品檢測[8]。另外，MG 弱毒疫苗并不能百分之百阻止MG 在雞群中的水平傳播。因此，部分雞群會出現(xiàn)免疫后感染的情況，這時，感染雞群體內(nèi)同時存在MG 弱毒疫苗株F 株和非F 株，會影響檢測結果的準確性，進而影響MG 的控制和凈化。另外，MG 與MS 經(jīng)常發(fā)生混合感染[9]，由于MS 也可引發(fā)氣囊炎等呼吸道癥狀，所以在臨床癥狀上較難與MG 感染進行區(qū)分。因此，建立一種能夠特異、快速區(qū)分MG 弱毒疫苗株F 株與非F 株以及MG 和MS 的檢測方法是非常必要的。本研究優(yōu)選合適的基因建立了能夠通過一次PCR 反應區(qū)分MG 弱毒疫苗株F 株與非F 株以及MG 和MS 的四重PCR 檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DL2000 DNA Marker 購自寶生物工程有限公司。瓊脂糖購自西班牙Biowest 公司，Goldview I 型核酸染色劑購自北京索萊寶有限公司，10×loading buffer 購自大連寶生物工程有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Bacteria DNA Kit）購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 毒株

MG 弱毒疫苗株F 株以及S6 株均由華中農(nóng)業(yè)大學微生物與免疫學實驗室保存，MG HS 株由華中農(nóng)業(yè)大學微生物與免疫學實驗室分離保存，滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）ATCC25204由甘肅農(nóng)業(yè)大學包世俊老師饋贈，鏈球菌SC19（由華中農(nóng)業(yè)大學張安定老師課題組饋贈），沙門氏菌（CVCC542）、大腸桿菌（ATCC25922）均由華中農(nóng)業(yè)大學栗紹文老師課題組饋贈。

1.3 引物的設計與合成

通過NCBI 中的GenBank 網(wǎng)站，選擇雞毒支原體F 株MGF_3486 基因序列（登入號：CP001873.1）、雞毒支原體Rlow 株MGA_0798 基因（登入號：AE015450.2）、雞毒支原體Rlow 株MGA_0319 基因（登入號：AE015450.2）以及登入號為JF449893 的MS 熱休克蛋白酶基因為靶標基因，將靶標基因進行BLAT 比對分析，分別選取靶基因序列的保守區(qū)設計了4 對多重PCR 引物，MG弱毒疫苗株F 株引物、MG 非F 株引物、MG 通用引物以及MS 引物分別以MGF、MGq、MGT、MS 表示，引物序列見表1。

表1 四重PCR引物序列信息

1.4 基因組的提取

根據(jù)細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書分別提取MG 弱毒疫苗株F 株、MG 強毒株S6 株以及HS 株，滑液囊支原體（MS）、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的基因組DNA 作為模板，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 四重PCR 引物特異性試驗

以MG 弱毒疫苗株F 株、MG 強毒株S6 株以及HS 株，滑液囊支原體（MS）、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的基因組DNA 作為模板，使用常規(guī)單重PCR 驗證MG 弱毒疫苗株F 株引物、MG 非F 株引物、MG 通用引物以及MS 引物的特異性或通用性。

1.6 四重PCR 反應條件的優(yōu)化

使用常規(guī)PCR 方法確定每一種引物的反應條件，反應體系為2×Taq PCR Master Mix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板1μL，無菌蒸餾水補充至20μL。在單重PCR 的基礎上，合理調(diào)整引物的濃度以及退火溫度等，逐級建立四重PCR 反應，確定四重PCR 的最佳反應條件。

1.7 四重PCR 反應的敏感性試驗

將MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MS 株的基因組濃度稀釋至10ng/μL，各取10μL 充分混合均勻，然后再將其依次進行10 倍倍比稀釋，設置101、102、103、104、105、106、107倍七個稀釋梯度，進行四重PCR 反應，檢測雞毒支原體、滑液囊支原體四重PCR 反應靈敏性。

2 結果

2.1 四重PCR 引物特異性試驗

1）MG 弱毒疫苗株F 株引物特異性試驗 利用1.6 中反應體系對MG 弱毒疫苗株F 株引物進行特異性檢測，僅有MG 弱毒疫苗株F 株能夠擴增出特異性條帶，條帶大小為750bp，符合結果預期。而MG-S6 株、MG-HS 株、MS、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均未擴增出特異性條帶，見圖1。

圖1 MG 弱毒疫苗株F 株引物特異性試驗

2）MG 非F 株引物特異性試驗 利用1.6 中反應體系對MG 非F 株引物進行特異性檢測，其中MG-S6 株、MG-HS 株能夠擴增出特異性條帶，條帶大小為585bp，符合結果預期。而MG 弱毒疫苗株F 株、MS、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均未擴增出特異性條帶，見圖2。

圖2 MG 非F 株引物特異性試驗

3）MG 通用引物特異性試驗 利用1.6 中反應體系對MG 通用引物進行特異性檢測，其中MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MGHS 株能夠擴增出特異性條帶，條帶大小為279bp，符合結果預期。而MS、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均未擴增出特異性條帶，見圖3。

圖3 MG 通用引物特異性試驗

4）MS 引物特異性試驗 利用1.6 中反應體系對MS 引物進行特異性檢測，其中MS 能夠擴增出特異性條帶，條帶大小為421bp，符合結果預期。而MG 弱毒疫苗株F 株、MG-S6 株、MG-HS 株、鏈球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等均未擴增出特異性條帶，見圖4。

圖4 MS 通用引物特異性試驗

2.2 四重PCR 反應體系的建立

利用單重PCR 反應體系中引物、模板比例以及反應條件經(jīng)多次摸索、反復驗證逐步建立二重PCR、三重PCR，最終建立MG、MS四重PCR 檢測方法，具體反應體系見表2。

表2 四重PCR反應體系

最佳反應條件：預變性95℃5min；變性95℃30s，退火51.5℃30s，延伸72℃1min，進行30 個循環(huán)；最后延伸72℃10min，4℃保存。

2.3 四重PCR 靈敏性檢驗

按照1.7 中各基因組處理方法制備PCR 反應模板，按照四重PCR 反應體系建立PCR 反應進行四重PCR 靈敏性檢驗，隨著模板濃度的降低，擴增條帶亮度逐漸降低，結果顯示：四重PCR 反應的最低檢出量均為100fg/μL，見圖5，表明本試驗建立的檢測方法靈敏度良好。

圖5 四重PCR 靈敏性試驗

3 討論

MG 主要引起雞的呼吸道癥狀，導致雞胴體合格率、受精率、產(chǎn)蛋率等下降，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前雞毒支原體的預防主要依靠疫苗免疫，而MG 弱毒疫苗株F 株的廣泛使用，使得弱毒疫苗株與非F 株的鑒別診斷成為了養(yǎng)殖業(yè)的難題，尤其是出現(xiàn)家禽疫苗免疫后再被野毒感染的情況，嚴重影響了養(yǎng)殖場的凈化檢測。MS 感染可引起家禽呼吸道癥狀、關節(jié)炎和氣囊炎等癥狀[10]，所以MS 感染和MG 感染癥狀相似，因此在臨床上難以區(qū)分。所以，建立一種可以區(qū)分MG 弱毒疫苗株F 株與非F 株以及MS 的檢測方法對于MG 和MS 的防控具有重要意義。

分子生物學方法在MG 和MS 的檢測中應用廣泛，尤以PCR方法應用最為廣泛，本研究根據(jù)GenBank 中MG 和MS 的相應序列，應用NCBI 中的Blast 功能進行基因序列分析，選取合適的基因片段設計合成了四套PCR 引物，通過對7 種抗原的檢測，驗證了引物的特異性。本研究與楊美等[11]、錢琳娜等[12]、楊斌等[13]建立的可以區(qū)分MG 和MS 的PCR 檢測方法相比，具有在一次PCR 反應基礎上區(qū)分MG 和MS 的同時又可以區(qū)分MG 弱毒疫苗株F 株與非F株的優(yōu)勢，為MG 和MS 的防控提供指導意見。

4 結論

本研究建立了雞毒支原體和滑液囊支原體的四重PCR 檢測方法，可以區(qū)分雞毒支原體弱毒疫苗株F 株和非F 株與滑液囊支原體。該方法靈敏度高，最低基因組檢測限度為100fg/μL，能夠為MG和MS 的凈化提供檢測技術支持。