α7nAChR激動(dòng)劑經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控NLRP3炎癥小體改善缺氧缺血性腦損傷的分子機(jī)制研究*

蔡群，張曉群，張志軍，沈麗媛

（1.南通大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 南通 226001； 2.南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，江蘇 南通 226001）

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic ischemic brain damage, HIBD）作為臨床常見的新生兒神經(jīng)疾病之一，若干預(yù)不及時(shí)可導(dǎo)致智力發(fā)育不足、癲癇等后遺癥，給家庭和社會(huì)帶來較大的影響[1]。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR）主要表達(dá)在巨噬細(xì)胞表面，經(jīng)其配體激活后參與膽堿能抗炎通路，可降低機(jī)體炎癥水平。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，α7nAChR激動(dòng)劑能減輕HIBD大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可能與其抑制炎癥作用有關(guān)。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）是一種能被多種外源物質(zhì)及自身危險(xiǎn)信號(hào)激活的炎癥小體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)炎癥相關(guān)疾病[3]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）參與激活NLRP3，但在不同類型細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制不同[4]。本研究擬探討α7nAChR激動(dòng)劑通過介導(dǎo)ERS調(diào)控NLRP3炎癥小體表達(dá)對(duì)HIBD的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇出生7 d左右的SPF級(jí)SD雄性大鼠48只，體重11～14 g，每12 h晝夜燈光輪流照射，環(huán)境溫度22～24 ℃，自由取食和飲水。所有大鼠均由北京維通利華動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2020-0024]。本研究嚴(yán)格遵守3R原則并經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)。試劑：α7nAChR激動(dòng)劑PNU282987（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），白細(xì)胞介素-18（IL-18）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司），TTC染色試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司），蘇木精-伊紅染液（上海信帆生物科技有限公司），TUNEL檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Roche公司），BCA蛋白定量試劑盒（合肥萊爾生物科技有限公司）。儀器：小動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司XR-Xmaze型），酶標(biāo)儀（型號(hào)：ST-MB96A，山東三體儀器有限公司），倒置顯微鏡（型號(hào)：CKX53，日本奧林巴斯株式會(huì)社），電泳儀（型號(hào)：16-8033，美國(guó)伯樂公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥

48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（S組）、模型組（HIBD組）、HIBD +α7nAChR激動(dòng)劑PNU282987組（HP組），每組16只。HIBD組和HP組大鼠均進(jìn)行HIBD模型復(fù)制；S組進(jìn)行假手術(shù)，不做結(jié)扎和缺氧處理。HIBD組和HP組均采用改良Rice法復(fù)制HIBD模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，碘伏消毒頸部，頸部正中偏左縱行5 mm切開皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露頸動(dòng)脈三角區(qū)，剝離出迷走神經(jīng)，采用5-0絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，縫合消毒。術(shù)后將幼鼠放回母鼠旁休息1 h后放置在缺氧箱（92% N2+ 8% O2）中缺氧處理2.5 h，缺氧過程大鼠出現(xiàn)晃頭、抽搐，缺氧處理結(jié)束后出現(xiàn)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)、四肢抖動(dòng)、夾尾、無法自主行走等癥狀視為模型復(fù)制成功。HP組模型復(fù)制成功后1 h腹腔注射0.8 mg/kg PNU282987，HIBD組和S組同時(shí)間腹腔注射0.02 mL/g生理鹽水。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

術(shù)后48 h每組大鼠均開展水迷宮實(shí)驗(yàn)，將一個(gè)圓形水池（直徑= 180 cm，高= 50 cm）等分為4個(gè)象限，中央原點(diǎn)放置一個(gè)低于水面1 cm的圓形平臺(tái)（直徑= 9 cm），水中加入染料隱蔽圓臺(tái)，水溫保持在22～25 ℃，采用小動(dòng)物行為分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠逃避潛伏期和2 min內(nèi)穿越圓臺(tái)的次數(shù)。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IL-18、IL-1β水平

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后2 h，給予大鼠注射戊巴比妥鈉麻醉，抽取其外周靜脈血，離心取上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，將標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋樣品分別加入到時(shí)孔板，并設(shè)置空白組和空白凋零組作為對(duì)照，在孔板上粘上覆膜，室溫孵育2 h后移去酶標(biāo)板液體并洗滌，隨后加入生物素化抗體、Streptavidin-HRP各100 μL，室溫孵育后洗滌，隨后顯色，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出樣本濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，計(jì)算出IL-18、IL-1β實(shí)際濃度。

1.5 HE染色觀察腦組織病理改變

取大腦組織并在4% 甲醛中固定過夜，石蠟包埋、切片，經(jīng)二甲苯和酒精脫蠟置水后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)變化。

1.6 TTC染色法檢測(cè)腦梗死面積

將各實(shí)驗(yàn)組大鼠斷頭法處死，取出完整大腦置于-20 ℃冰箱冷凍20 min后取出，快速自前腦額極平行切成厚度約2 mm的冠狀切片，將其放入TTC染液中避光孵育20 min，每隔5 min將切片翻轉(zhuǎn)1次，染色結(jié)束后取出，用PBS沖洗干凈，相機(jī)拍照。腦梗死面積百分比（%）=梗死面積/橫切片總面積×100%。

1.7 TUNEL法檢測(cè)大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

按照1.6中方法獲取各組大鼠腦組織及左側(cè)海馬體石蠟切片，采用TUNEL染色試劑盒檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，找到每張切片上大腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)域，光學(xué)顯微鏡下觀察，棕黃、棕褐色細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為正常細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/視野總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8 Western blotting檢測(cè)腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)

取各組大鼠左側(cè)海馬組織在冰上研磨并加入細(xì)胞裂解液，取上清液采用BCA標(biāo)準(zhǔn)蛋白定量化測(cè)定蛋白濃度，合格后取50 μL樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入NLRP3、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein78, GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein, CHOP）一抗（稀釋濃度均為1∶1 000）孵育過夜、加二抗室溫孵育2 h，加入ECL顯色液在暗室下曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組的比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿越圓臺(tái)次數(shù)的比較

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S組、HIBD組及HP組逃避潛伏期、穿越圓臺(tái)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HIBD組和HP組逃避潛伏期較S組延長(zhǎng)（P＜0.05），穿越圓臺(tái)次數(shù)較S組減少（P＜0.05）；HP組逃避潛伏期較HIBD組縮短（P＜0.05），穿越圓臺(tái)次數(shù)較HIBD組增加（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿越圓臺(tái)次數(shù)的比較 （n =16，±s）

表1 3組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿越圓臺(tái)次數(shù)的比較 （n =16，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值逃避潛伏期/s 6.82±1.84 26.04±5.72①16.08±4.13①②26.024 0.000穿越圓臺(tái)次數(shù)10.63±2.42 2.23±0.54①6.53±1.58①②15.054 0.000

2.2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平比較

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，S組、HIBD組和HP組IL-18、IL-1β水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HIBD組和HP組IL-18、IL-1β水平較S組升高（P＜0.05），HP組IL-18、IL-1β水平較HIBD組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平的比較（n =16，pg/mL，±s）

表2 3組大鼠血清IL-18、IL-1β水平的比較（n =16，pg/mL，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值IL-18 47.23±8.24 155.36±14.38①109.26±11.37①②125.084 0.000 IL-1β 28.15±4.02 92.34±10.26①58.6±7.25①②26.258 0.000

2.3 3組大鼠腦組織病理改變

HE染色結(jié)果顯示，S組腦皮層完整，細(xì)胞排列正常，無明顯神經(jīng)元損傷；HIBD組可見腦皮層神經(jīng)元排列較為紊亂，細(xì)胞間隙變寬，細(xì)胞膜破裂；HP組神經(jīng)元排列紊亂，水腫程度、壞死程度較HIBD組輕。見圖1。

圖1 3組大鼠腦組織病理改變 （HE染色×400）

2.4 3組大鼠腦梗死面積比較

TTC染色結(jié)果顯示，S組、HIBD組和HP組腦梗死面積的占比分別為（0.02±0.01）%、（27.16±4.38）%、（18.29±3.96）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=256.158，P=0.000）。其中S組無明顯梗死灶，HIBD組和HP組均可見白色梗死灶，HP組梗死面積占比明顯低于HIBD組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 大鼠腦梗死面積 （TTC染色）

2.5 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較

TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，S組、HIBD組和HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HIBD組和HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較S組升高（P＜0.05），HP組腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較HIBD組降低（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 （n =16，%，±s）

表3 3組大鼠腦皮層、海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 （n =16，%，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值腦皮層0.97±0.43 43.24±6.83①23.86±5.22①②92.056 0.000海馬CA1區(qū)1.03±0.54 43.72±6.05①17.83±4.26①②124.056 0.000

2.6 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)比較

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，S組、HIBD組和HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），HIBD組、HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量較S組升高（P＜0.05），HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量較HIBD組降低（P＜0.05）。見 表4和圖3。

圖3 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)

表4 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =16，±s）

表4 3組大鼠腦組織中NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =16，±s）

注 ： ①與S組比較，P ＜0.05； ②與HIBD組比較，P ＜0.05。

組別S組HIBD組HP組F 值P 值CHOP蛋白1.11±0.22 2.05±0.51①1.53±0.42①②3.264 0.018 GRP78蛋白0.97±0.18 6.16±0.54①2.38±0.32①②7.264 0.000 NLRP3蛋白1.04±0.28 7.75±1.32①5.36±0.87①②26.251 0.000

3 討論

HIBD多由圍生期窒息所引發(fā)的新生兒腦損傷疾病，其病理機(jī)制與炎癥所引發(fā)的神經(jīng)元炎癥因子浸潤(rùn)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[5]。目前HIBD尚無確切有效的治療方法，臨床常采用的亞低溫治療，預(yù)后并不十分理想[6]，而深入了解HIBD發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找更有效的治療方法具有重要意義。

α7nAChR是一種表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞表面的配體依賴性離子通道受體，主要有抗炎作用[7-8]。相關(guān)研究[9]顯示，α7nAChR激動(dòng)劑能通過抑制炎癥因子表達(dá)改善體循環(huán)引發(fā)的大鼠腦損傷，但在HIBD中的作用尚不明確。本研究結(jié)果顯示，HIBD模型復(fù)制成功后，HIBD組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越圓臺(tái)次數(shù)減少，表現(xiàn)為大腦神經(jīng)功能異常，而在注射α7nAChR激動(dòng)劑后HP組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越圓臺(tái)次數(shù)增加，提示α7nAChR激動(dòng)劑可改善大鼠大腦神經(jīng)功能。HE染色結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。此外，HIBD組、HP組腦梗死面積占比、腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例較S組升高，HP組腦梗死面積占比、腦皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率較HIBD組降低，表明α7nAChR激動(dòng)劑可能通過減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來改善神經(jīng)功能，而炎癥因子的大量表達(dá)可能參與了此過程[10]。

NLRP3是NLR家族研究最多的炎癥小體，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其參與了HIBD的發(fā)生、發(fā)展過程[11]。相關(guān)研究[12-14]顯示，巨噬細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞可在多種炎癥因子的刺激下激活細(xì)胞質(zhì)中NLRP3炎癥小體，如外界炎癥信號(hào)誘導(dǎo)的ERS可通過K+外流、溶酶體損傷模型和活性氧（ROS）途徑激活NLRP3。本次研究發(fā)現(xiàn)，HIBD組、HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量較S組升高，HP組NLRP3、GRP78、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量較HIBD組降低，提示α7nAChR激動(dòng)劑可能通過抑制ERS途徑相關(guān)GRP78/CHOP通路蛋白表達(dá)來降低腦組織中NLRP3炎癥小體的表達(dá)。馬度芳等[15]發(fā)現(xiàn)，α7nAChR激動(dòng)劑能抑制ERS途徑和穩(wěn)定線粒體功能，減少ROS釋放；而ROS大量釋放可刺激NLRP3炎癥小體激活[16]，這可能是α7nAChR激動(dòng)劑能降低NLRP3表達(dá)的原因之一。而NLRP3炎癥小體激活后可通過相關(guān)信號(hào)促進(jìn)IL-18、IL-1β等炎癥因子的成熟和大量表達(dá)，釋放的IL-18、IL-1β可募集更多其他的炎癥因子和細(xì)胞，導(dǎo)致腦組織炎癥損傷[17-18]。本研究結(jié)果顯示，HIBD組、HP組血清IL-18、IL-1β水平較S組升高，HP組血清IL-18、IL-1β水平較HIBD組降低，提示α7nAChR激動(dòng)劑能降低HIBD大鼠體內(nèi)的炎癥水平。LEAVY等[19]認(rèn)為，腦組織受損及神經(jīng)細(xì)胞能量代謝紊亂能誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生ERS，出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊和未折疊的蛋白聚集，激活NLRP3和相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，導(dǎo)致大鼠發(fā)生腦梗死和神經(jīng)功能障礙。BECKMANN等[20]研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠與成年大鼠在HIBD實(shí)驗(yàn)中NLRP3表達(dá)出現(xiàn)峰值時(shí)間存在差異，可能與HIBD的不同發(fā)展階段有關(guān)，具體情況有待進(jìn)一步研究論證。

綜上所述，α7nAChR激動(dòng)劑可改善大鼠HIBD腦損傷，其機(jī)制可能與抑制ESR途徑、降低NLRP3炎癥小體表達(dá)有關(guān)，NLRP3及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)在大鼠神經(jīng)元損傷及神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了保護(hù)作用，這可能為HIBD治療藥物研究提供新的思路和方向。